Koji izravni dokazi kod odraslih osoba pokazuju da vremenski ograničena prehrana, povremeni post, produljeni post ili naknadno ponovno hranjenje mijenjaju autofagiju ili autofagni fluks u ljudskim tkivima ili stanicama te koliko su ti dokazi snažni?
Izravno mjerenje autofagnog fluksa u ljudi pokazuje da višednevni post (3-5 dana) aktivira autofagiju u metabolički aktivnim tkivima poput skeletnog mišića i specifičnih populacija imunoloških stanica, no svakodnevna vremenski ograničena prehrana i noćni post proizvode nedosljedne ili minimalne učinke koji znatno variraju ovisno o vrsti tkiva, metodi mjerenja i individualnom zdravstvenom statusu, pri čemu najsnažniji dokazi proizlaze iz studija koje koriste lizosomske inhibitore za mjerenje fluksa umjesto statičke zastupljenosti markera.
Sažetak
Četrnaest studija koje su ispitivale odgovore autofagije na intervencije posta u odraslih osoba otkriva heterogenu kvalitetu dokaza i tkivno specifične odgovore. Studije koje su koristile validirane testove autofagijskog fluksa s lizosomskim inhibitorima pružaju najsnažnije dokaze: petodnevna dijeta koja oponaša post pojačala je autofagijski fluks u mononuklearnim stanicama periferne krvi u usporedbi s kontrolnom skupinom (p=0.0191) [1], a četverodnevni potpuni post aktivirao je fluks u neutrofilima kada je mjeren na odgovarajući način [2]. Nasuprot tome, 12-satni noćni post praćen ponovnim unosom hrane nije promijenio fluks u dvjema studijama na 42 zdrave odrasle osobe [3, 4]. Produženi post (72 sata) dosljedno je aktivirao komponente autofagijskog puta u skeletnim mišićima, uključujući ~50% smanjenu fosforilaciju mTOR-a [5] i povećanu ekspresiju ULK1 [6], iako su statička mjerenja biljega koja su pokazala istovremeni porast LC3B-II i p62 onemogućila definitivno određivanje fluksa [5, 6]. Dnevno vremenski ograničeno hranjenje (prozori od 6-8 sati) polučilo je skromne učinke nakon 4 dana do 8 tjedana, povećavajući ekspresiju LC3A za 22% [7] i razine ATG-5 [8]. Uočeni su tkivno specifični odgovori, pri čemu su biljezi autofagije u krvi uglavnom ostali nepromijenjeni nakon 12-satnog posta u kritično oboljelih bolesnika i zdravih kontrola [9], dok je post povećao udio autofagijskih monocita, ali ne i limfocita [10]. Kronična bubrežna bolest poništila je aktivaciju autofagije opaženu u zdravih ispitanika tijekom noćnog posta (omjer γLC3 0.92 vs 1.78, p<0.0001) [11]. Intenzitet tjelovježbe pokazao se značajnijim od stanja posta u aktivaciji autofagije skeletnih mišića putem AMPK-ovisnih putova [12]. Dokazi upućuju na to da višednevni post aktivira autofagiju u metabolički aktivnim tkivima kada se mjeri validiranim metodama fluksa, dok kraća razdoblja dnevnoga posta pokazuju nedosljedne učinke koji variraju ovisno o vrsti tkiva, vremenu mjerenja i individualnom metaboličkom kapacitetu.
Dijagram toka
Pretraživanje radova
Korpus PubMed
Proveli smo pretraživanje po ključnim riječima u korpusu PubMed.
(autophagy OR autophagic flux OR LC3 OR SQSTM1 OR p62 OR ULK1 OR Beclin-1 OR ATG) AND (fasting OR starvation OR "time-restricted eating" OR "time restricted feeding" OR intermittent fasting) AND humans
Pretraga je dala ukupno 300 rezultata iz baze PubMed.
Korpus Elicit
Proveli smo semantičko pretraživanje više od 138 milijuna znanstvenih radova putem tražilice Elicit, koja obuhvaća cjelokupne baze Semantic Scholar i OpenAlex.
Izvršili smo sljedeće upite:
- "human fasting skeletal muscle blood leukocyte PBMC autophagy LC3 p62"
- "prolonged fasting refeeding human autophagy autophagic flux biomarker study"
Pretraživanja su dala ukupno 600 rezultata iz tražilice Elicit.
Dohvatili smo 794 rada najrelevantnija za upit radi probira.
Probir
Probir sažetaka
Uvrstili smo izvore na temelju njihovih sažetaka koji su ispunjavali sljedeće kriterije:
- Odrasli ljudi: Izvještavaju li naslov ili sažetak o studiji provedenoj na odraslim ljudima (od 18 godina ili starijima) ili o kohorti mješovite dobi koja uvjerljivo može uključivati odrasle osobe?
- Primarna završena studija: Je li riječ o primarnom izvješću o završenoj studiji na ljudima, a ne o preglednom radu, protokolu, radu o metodologiji, uvodniku, ispravku (erratum) ili sažetku s konferencije?
- Izloženost postu: Procjenjuju li naslov ili sažetak definiranu izloženost postu, vremenski ograničenom hranjenju (time-restricted eating/feeding), povremenom postu, postu svaki drugi dan ili ponovnom hranjenju nakon posta?
- Ishod povezan s autofagijom: Navodi li se u naslovu ili sažetku mjerenje autofagije, autofagnog fluksa ili molekularnog/staničnog biljega povezanog s autofagijom?
Radovi koji nisu zadovoljili bilo koji od strogih kriterija automatski su isključeni. Za preostale radove razmotrili smo sva pitanja za probir zajedno te donijeli holističku procjenu o tome treba li pojedini rad uvrstiti.
36 radova prošlo je probir sažetaka i upućeno na probir cjelovitog teksta.
Prilikom probira sažetaka, broj radova isključenih prema primarnom razlogu bio je:
- Odrasli ljudi: n = 463
- Primarna završena studija: n = 67
- Izloženost postu: n = 144
- Ishod povezan s autofagijom: n = 82
- Ostalo / ispod praga probira: n = 2
Probir cjelovitog teksta
Zatim smo proveli probir radova na temelju cjelovitog teksta primjenom ovih dodatnih kriterija:
- Podaci o odraslim ljudima: Uključiti samo izvješća s podacima pogodnim za analizu dobivenim od odraslih osoba u dobi od 18 godina ili starijih.
- Definirana izloženost: Uključiti samo studije s dostatno opisanom izloženošću postu ili ponovnom hranjenju, uključujući trajanje ili dnevni vremenski prozor hranjenja.
- Izravno mjerenje autofagije: Uključiti samo studije koje izravno mjere autofagiju ili autofagni fluks u biološkom uzorku čovjeka primjenom barem jednog molekularnog, proteinskog, slikovnog ili lizosomskog/autofagosomskog biljega. Isključiti studije koje prate isključivo metaboličke, upalne, dugovječne ili kliničke ishode.
- Primarno završeno izvješće: Uključiti samo završena primarna istraživačka izvješća s rezultatima, isključujući pregledne radove, protokole, narativne tekstove i sažetke s konferencija.
Radovi koji nisu zadovoljili bilo koji od strogih kriterija automatski su isključeni. Za preostale radove razmotrili smo sva pitanja za probir zajedno te donijeli holističku procjenu o tome treba li pojedini rad uključiti u konačnu analizu.
14 radova prošlo je probir cjelovitog teksta i upućeno na ekstrakciju podataka.
Prilikom probira cjelovitog teksta, broj radova isključenih prema primarnom razlogu bio je:
- Podaci o odraslim ljudima: n = 1
- Definirana izloženost: n = 1
- Izravno mjerenje autofagije: n = 4
- Nedostupan cjeloviti tekst: n = 16
Ekstrakcija podataka
Zatražili smo od velikog jezičnog modela da iz svakog rada ekstrahira svaki od dolje navedenih stupaca podataka. Modelu smo dali upute za ekstrakciju prikazane u nastavku za svaki stupac.
- Identitet i dizajn studije: Ekstrahirati citat, zemlju ako je navedena, dizajn (randomizirani, križni, kontrolirano hranjenje, prospektivni mehanistički ili drugi), analiziranu veličinu uzorka i karakteristike populacije.
- Izloženost i komparator: Precizno ekstrahirati režim posta: dnevni prozor hranjenja, trajanje posta, dopušteni energetski unos, broj ciklusa/dana, upute o tjelesnoj aktivnosti te komparator ili početne vrijednosti.
- Biološki uzorak i vremenski raspored: Ekstrahirati vrstu uzorka/tkiva/stanica, vrijeme uzorkovanja u odnosu na posljednji kalorijski unos i ponovno hranjenje te informaciju o tome je li provedeno ponovljeno uzorkovanje unutar istog ispitanika.
- Mjerenje autofagije i mogućnost interpretacije: Ekstrahirati svaki test/biljeg povezan s autofagijom, procjenjuje li fluks naspram statičkog surogata obilnosti/ekspresije, smjer promjene i ograničenja testa koja navode autori.
- Primarni nalazi o autofagiji: Ekstrahirati numeričke rezultate gdje su dostupni, mjeru nesigurnosti / statistički test i zaključak autora o autofagiji.
- Metabolički kontekst i sigurnost: Ekstrahirati ketone, glukozu, inzulin, promjenu tjelesne mase, štetne događaje i prekide sudjelovanja samo ako su prijavljeni.
- Signali rizika od pristranosti: Ekstrahirati značajke dizajna relevantne za pristranost: alokaciju/randomizaciju, kontrolu/komparator, zasljepljivanje laboratorijskih ishoda, podatke koji nedostaju, prethodnu specifikaciju protokola i sukobe interesa.
Rezultati
Karakteristike uključenih studija
Uključeno je četrnaest studija koje su ispitivale autofagiju kao odgovor na post ili vremenski ograničenu prehranu. Puni tekstovi pribavljeni su za sve studije. Veličine uzoraka kretale su se od 7 do 70 sudionika, pri čemu je većina studija uključivala zdrave odrasle osobe. Studije su primarno provedene u Europi (Belgija, Danska) i Sjedinjenim Američkim Državama, uz dodatne studije iz Tajvana i Rusije. Dizajni studija uključivali su randomizirana ukrižena ispitivanja, studije s kontroliranim unosom hrane i prospektivne mehanističke studije.
| Studija | Puni tekst pribavljen? | Zemlja | Dizajn | Veličina uzorka | Populacija | Režim posta | Uzorak/tkivo | Primarni nalaz o autofagiji |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Humaira Jamshed et al., 2019 [7] | Da | Sjedinjene Američke Države [7] | Randomizirano ukriženo ispitivanje s kontroliranim unosom hrane [7] | 11 [7] | Općenito zdrave odrasle osobe u dobi od 20-45 godina, BMI 25.0-35.0 kg/m² [7] | eTRF: prozor hranjenja 8:00–14:00 (6 h) u odnosu na kontrolnu skupinu 8:00–20:00 (12 h), 4 dana [7] | Puna krv [7] | Povećana ekspresija LC3A za 22% ujutro (p=0.001) [7] |
| C. Schwalm et al., 2017 [13] | Da | Belgija [13] | Randomizirano ukriženo ispitivanje s kontroliranim unosom hrane i tjelovježbom [13] | 7 [13] | Trenirani sportaši, dob 24±1 godina, V˙O2peak 64.5±1.7 mL/min/kg [13] | 8 h noćnog posta, samo voda u odnosu na stanje sitosti s doručkom i napitkom s ugljikohidratima tijekom 2 h vožnje bicikla [13] | Mišić vastus lateralis [13] | Mitofagija nije aktivirana tijekom ili neposredno nakon vježbanja; omjer LC3bII/LC3bI smanjen nakon vježbanja u stanju posta (p=0.019) [13] |
| F. Pietrocola et al., 2017 [2] | Da | Nije navedeno [2] | Prospektivna mehanistička studija [2] | 9 [2] | Zdrave osobe, dob 24-54, BMI 20-25 [2] | Nekalorijska dijeta (samo voda, čaj, kava) tijekom 4 dana [2] | Bijele krvne stanice [2] | Aktivacija autofagije uočljiva u neutrofilima nakon ex vivo uzgoja s leupeptinom; izraženo smanjenje acetilacije lizina u proteinima [2] |
| M. Vendelbo et al., 2014 [5] | Da | Danska [5] | Randomizirano ukriženo ispitivanje [5] | 8 [5] | Zdravi muški dobrovoljci, dob 26-64 godine, BMI 23.8 kg/m² [5] | 72 h posta uz dozvoljenu vodu iz slavine u odnosu na noćni post [5] | Skeletni mišić (vastus lateralis) [5] | LC3B-II povećan za ~30%; p62 povećan za ~10%, što otežava interpretaciju fluksa; fosforilacija mTOR-a smanjena za ~50% [5] |
| C. Schwalm et al., 2015 [12] | Da | Belgija [12] | Randomizirano ukriženo ispitivanje s kontroliranim unosom hrane i tjelovježbom [12] | 23 [12] | Dobro utrenirani sportaši [12] | 8 h noćnog posta u odnosu na stanje sitosti tijekom 2 h vožnje bicikla pri 55% ili 70% VO2 peak [12] | Mišić vastus lateralis [12] | Intenzitet vježbanja značajniji od prehrane; vježbanje visokog intenziteta povećalo je autofagni fluks (smanjeni LC3bII i p62/SQSTM1); povezano s povećanom aktivnošću AMPKα [12] |
| J. Kröpfl et al., 2022 [10] | Da | Nije specificirano [10] | Prospektivna mehanistička studija s ponovljenim mjerenjima [10] | 8 [10] | Zdrave odrasle osobe [10] | 14-15 h posta u odnosu na standardizirani doručak [10] | Periferna krv (limfociti i monociti) [10] | Post je povećao koncentracije autofagnih monocita (p=0.026); tjelovježba je povećala koncentracije autofagnih limfocita (p=0.043); negativna korelacija između LC3BII/I i broja autofagnih stanica (r=-0.74, p=0.02) [10] |
| Sara E. Espinoza et al., 2025 [1] | Da | Sjedinjene Američke Države [1] | Randomizirano kliničko ispitivanje [1] | 30 [1] | Zdrave odrasle osobe u dobi od 25-65 godina, prosječna dob 49.1±11.8 godina [1] | Dijeta koja oponaša post: 1100 kcal 1. dan, 700-800 kcal 2.–5. dan, zatim ponovno hranjenje [1] | Mononuklearne stanice periferne krvi (PBMC) [1] | FMD je pojačao autofagni fluks kroz povećanu autofagnu degradaciju; kontrolna skupina imala je viši omjer LC3B-II/LC3B-I u odnosu na FMD skupine (p=0.0191) [1] |
| Ann Mosegaard Bak et al., 2016 [6] | Da | Danska [6] | Randomizirano ukriženo ispitivanje [6] | 18 [6] | Devet vitkih (BMI 19-23) i devet pretilih (BMI 32-40) muškaraca u dobi od 20-35 godina [6] | 12 h posta u odnosu na 72 h posta [6] | Mišićno (vastus lateralis) i masno tkivo [6] | Razine ULK1 mRNA i proteina povećale su se uz 72 h posta; omjer ULK1 p-Ser 757/ukupni ULK1 se smanjio; p62 mRNA i protein su se povećali, što otežava interpretaciju fluksa [6] |
| Sanjna Singh et al., 2025 [3] | Da | Nije navedeno [3] | Jednoruka pre-post studija [3] | 42 [3] | Zdrave osobe [3] | 12 h noćnog posta praćeno visokoproteinskim obrokom [3] | Mononuklearne stanice periferne krvi [3] | Nema promjene u autofagnom fluksu između noćnog posta i 1 h nakon visokoproteinskog obroka; spolni dimorfizam pri čemu žene imaju veći fluks od muškaraca (p=0.0031) [3] |
| S. Singh et al., 2024 [4] | Da | Nije navedeno [4] | Jednoruka pre-post studija [4] | 42 [4] | Zdrave osobe [4] | 12 h noćnog posta praćeno visokoproteinskim obrokom [4] | Mononuklearne stanice periferne krvi [4] | Nema promjene u autofagnom fluksu između stanja posta i postprandijalnog stanja [4] |
| Wei-Ting Chen et al., 2013 [11] | Da | Tajvan [11] | Prospektivna studija slučajeva i kontrola [11] | 90 [11] | 60 bolesnika s 5. stadijem CKD-a i 30 dobi i spolu usklađenih zdravih kontrolnih ispitanika, u dobi od 20-79 godina [11] | Noćni post (12 h) praćen doručkom [11] | Leukociti [11] | Noćni post inducirao je autofagiju kod zdravih ispitanika (omjer γLC3 1.78), ali ne i kod bolesnika s CKD-om (omjer γLC3 0.92-1.22, p<0.0001) [11] |
| L. Van Dyck et al., 2020 [9] | Da | Belgija [9] | Randomizirana ukrižena pilot-studija [9] | 70 [9] | Odrasli dugotrajno kritično oboljeli bolesnici (≥18 godina) ovisni o mehaničkoj respiratornoj i hemodinamskoj potpori [9] | 12 h hranjenja u odnosu na 12 h posta, izmjenjivano na dan 8±1 [9] | Puna krv i izolirane bijele krvne stanice [9] | Markeri autofagije u uzorcima krvi uglavnom nisu bili pod utjecajem posta; autori zaključuju da uzorci krvi možda ne odražavaju autofagiju u drugim tkivima [9] |
| Tugce Ozlu Karahan et al., 2025 [8] | Da | Turska (izvedeno) [8] | Randomizirano kontrolirano ispitivanje [8] | 48 [8] | Odrasle osobe s prekomjernom tjelesnom masom ili pretilošću s MAFLD-om, u dobi od 18-65 godina, BMI ≥25 kg/m² [8] | Energetski restriktivna dijeta (22-25 kcal/kg/dan) u odnosu na energetski + vremenski restriktivnu dijetu (obrazac 16:8, od 10:00–12:00 do 18:00–20:00) [8] | Krv (serumski markeri) [8] | Razine ATG-5 povećale su se u skupini na energetski + vremenski restriktivnoj dijeti (s 0.74 na 0.95 ng/mL, p=0.03); pozitivna korelacija između FGF-21 i ATG-5 (R=0.343, p=0.02) [8] |
| I. Tkhakushinov & S. Lysenkov, 2022 [14] | Da | Rusija [14] | Kontrolirani unos hrane s djelomičnom deprivacijom hrane [14] | 20 [14] | Muškarci podijeljeni u tri dobne skupine: mlađa (18-44 godine), srednja (45-60 godina) i starija (61-75 godina) [14] | Djelomična deprivacija hrane (800-120 kcal na dan) tijekom 12 dana [14] | Krv [14] | Dob je vodeći čimbenik koji utječe na aktivnost autofagije; aktivnost autofagije opada s dobi [14] |
Studije su ispitivale različite režime posta, u rasponu od 8-satnog noćnog posta do potpunog 4-dnevnog posta, s mjerenjima provedenim u različitim tkivima, uključujući skeletne mišiće, krvne stanice i mononuklearne stanice periferne krvi. Većina studija koristila je ukriženi dizajn u kojem su sudionici služili kao vlastite kontrole, uz mjerenja prije i nakon intervencija postom.
Metode mjerenja autofagije i mogućnost interpretacije
Studije su primjenjivale heterogene metode testiranja s različitim kapacitetom razlikovanja autofagnog fluksa od statičke abundancije markera. Obrada LC3 (microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3) bila je najčešće prijavljivani marker, procjenjivana putem omjera LC3B-II/LC3B-I [1, 5, 10, 13], lipidacije LC3 [2] ili ekspresije gena LC3A/LC3B [7]. Dodatni markeri uključivali su p62/SQSTM1 (sequestosome 1) [5, 12, 13], fosforilaciju ULK1 (unc-51 like autophagy activating kinase 1) [5, 6, 12], ATG (autophagy-related) proteine [8], Beclin-1 [8, 11, 14] i signalizaciju mTOR-a (mechanistic target of rapamycin) [5].
Pojavile su se ključne metodološke razlike u pogledu mjerenja fluksa u odnosu na statička mjerenja. Nekoliko studija mjerilo je autofagni fluks pomoću lizosomskih inhibitora: Espinoza i sur. tretirali su PBMC klorokinom ex vivo, mjereći akumulaciju LC3B-II kao validirani pokazatelj fluksa [1]. Slično tome, Pietrocola i sur. injicirali su leupeptin prije uzimanja krvi kod miševa te kultivirali ljudske leukocite ex vivo s leupeptinom, utvrdivši da se aktivacija autofagije može detektirati samo uz inhibiciju proteaza [2]. Singh i sur. 2024. i 2025. dodali su lizosomske inhibitore izravno u punu krv, kvantificirajući nakupljanje LC3B-II putem ELISA-e kao fiziološki relevantnu mjeru fluksa [3, 4]. Nasuprot tome, većina studija mjerila je statičku abundanciju markera autofagije bez procjene fluksa, što je dovelo do izazova u interpretaciji.
Omjer LC3B-II/LC3B-I primjer je tog ograničenja. Iako se uobičajeno koristi kao pokazatelj autofagije, povišeni LC3B-II može odražavati ili povećano formiranje autofagosoma ili narušenu degradaciju autofagosoma [5]. Vendelbo i sur. utvrdili su da se LC3B-II povećao za ~30% tijekom 72-satnog posta, ali se i p62 povećao za ~10%, što otežava interpretaciju budući da se p62 tipično razgrađuje tijekom autofagije [5]. Autori su napomenuli da nisu mogli definitivno odrediti autofagni fluks iz ovih kontradiktornih markera [5]. Bak i sur. izvijestili su o sličnim obrascima: ULK1 se povećao, a njegova inhibitorna fosforilacija smanjila s postom, što sugerira aktivaciju autofagije, no p62 mRNA i protein također su se povećali [6]. Obje su studije potvrdile da ovi podaci ne mjere izravno fluks [5, 6].
Studije koje su koristile komplementarne markere pružile su robusnije dokaze. Schwalm i sur. 2015. mjerili su fosforilaciju ULK1, omjer LC3bII/I, protein p62/SQSTM1 i ekspresiju gena povezanih s autofagijom, utvrdivši smanjene razine LC3bII i p62 nakon vježbanja visokog intenziteta, što ukazuje na povećani fluks [12]. Smanjene razine obaju markera, a ne samo jednog, uvjerljivije su demonstrirale autofagnu degradaciju. Slično tome, Kröpfl i sur. kombinirali su protočnu citometriju za LC3B-pozitivne stanice s Western blot analizom za omjere LC3BII/I, iako su uočili negativnu korelaciju između ovih mjera u monocitima [10], što sugerira složenu regulaciju koja nije u potpunosti obuhvaćena pojedinačnim markerima.
Više studija istaknulo je tkivno specifične odgovore autofagije. Van Dyck i sur. utvrdili su da su markeri autofagije u uzorcima krvi uglavnom nepromijenjeni nakon 12-satnog posta kod kritično oboljelih bolesnika i zdravih kontrola, što je navelo autore na zaključak da krv možda ne odražava autofagiju u drugim tkivima [9]. Kröpfl i sur. primijetili su diferencijalne odgovore u limfocitima u odnosu na monocite: post je povećao koncentracije autofagnih monocita, ali ne i limfocita, dok je tjelovježba povećala autofagne limfocite, ali ne i monocite [10]. Chen i sur. demonstrirali su da noćni post aktivira autofagiju u leukocitima zdravih ispitanika, ali ne i kod bolesnika s kroničnom bubrežnom bolešću [11], što ukazuje na to da stanje bolesti može poništiti tipične odgovore autofagije.
Ograničenja koja su naveli autori potvrdila su ove izazove u mjerenju. Više studija navodi da genska ekspresija možda ne odražava razine proteina ili funkcionalnu aktivnost [7], pojedinačne vremenske točke mogu propustiti dinamičke promjene [4], a autofagija u krvi možda ne predstavlja odgovore u metabolički aktivnim tkivima poput jetre ili mišića [4, 9]. Espinoza i sur. naveli su malu veličinu uzorka i kratko razdoblje procjene kao ograničenja [1], dok su Karahan i sur. napomenuli da je njihova procjena isključivo ATG-5 i Beclin-1, bez evaluacije p62/SQSTM1, ograničila interpretaciju autofagnog fluksa [8].
Nalazi o autofagiji prema izloženosti postu
Vremenski ograničena prehrana (dnevni prozori hranjenja)
Dvije su studije ispitivale svakodnevnu vremenski ograničenu prehranu s prozorima hranjenja od 6 do 8 sati. Jamshed i sur. utvrdili su da je rano vremenski ograničeno hranjenje (eTRF; 8:00–14:00, 6-satni prozor) povećalo ekspresiju gena LC3A za 22% ujutro u usporedbi s 12-satnim kontrolnim prozorom (8:00–20:00), uz p=0.001 [7]. Ovo povećanje zabilježeno je u stanicama pune krvi nakon 4 dana eTRF-a [7]. Međutim, LC3A je statički marker genske ekspresije, a ne izravna mjera fluksa [7], a autori su napomenuli da genska ekspresija možda ne odražava razine proteina [7]. Metabolički kontekst uključivao je smanjenje 24-satnih razina glukoze za 4±1 mg/dL (p=0.0003) i povećanje jutarnjih ketona za 0.03±0.01 mM (p=0.009) [7].
Karahan i sur. usporedili su energetsku restrikciju samu za sebe s energetskom restrikcijom u kombinaciji s vremenski ograničenom prehranom 16:8 (prozor hranjenja od 10:00 do 20:00) u 48 odraslih osoba s metabolički disfunkcionalnom masnom bolešću jetre [8]. Razine ATG-5 značajno su porasle samo u skupini s vremenskim ograničenjem nakon 8 tjedana, s 0.74 na 0.95 ng/mL (p=0.03) [8], uz pozitivnu korelaciju između serumskog FGF-21 i ATG-5 (R=0.343, p=0.02) [8]. ATG-5 predstavlja statički serumski marker [8], a studija je navela ograničenja u procjeni fluksa bez evaluacije p62/SQSTM1 [8]. Obje su skupine pokazale gubitak tjelesne mase i poboljšanje metaboličkih markera, uključujući smanjenje glukoze natašte i jetrenih enzima [8].
Povremeni post i noćni post
Istraživanja noćnog posta u trajanju od 8 do 15 sati otkrila su tkivno specifične i o kontekstu ovisne odgovore autofagije. Chen i sur. pokazali su da je 12-satni noćni post inducirao aktivaciju autofagije u zdravih ispitanika, što je vidljivo iz konverzije LC3-I u LC3-II (omjer γLC3 1.78) te povećane razine mRNA za Atg5 i Beclin-1 [11]. Ovaj je odgovor izostao u bolesnika s kroničnom bubrežnom bolešću (omjer γLC3 0.92-1.22, p<0.0001) [11], a hemodijaliza nije obnovila aktivaciju autofagije [11]. Mjerenja su provedena u leukocitima prikupljenima nakon noćnog posta i 2 sata nakon doručka [11].
Dvije studije koje su proveli Singh i sur. ispitivale su mijenja li obrok bogat bjelančevinama nakon 12-satnog noćnog posta autofagiju u 42 zdrave odrasle osobe. Koristeći ELISA metodu pojačanu lizosomskim inhibitorom za mjerenje autofagijskog fluksa u PBMC [3, 4], obje su studije utvrdile izostanak promjene u fluksu između stanja posta i 1 sat nakon konzumacije obroka [3, 4]. Autori su napomenuli kako to dovodi u pitanje pretpostavke da akutne nutritivne intervencije mijenjaju autofagiju u ljudi [4] te su sugerirali da uzorkovanje 1 sat nakon obroka možda nije bilo optimalno vremenski tempirano [4]. Značajno je da su žene imale viši autofagijski fluks od muškaraca (p=0.0031) [3], što predstavlja spolni dimorfizam neovisan o intervenciji obrokom.
Schwalm i sur. 2017. ispitivali su 8-satni noćni post u kombinaciji s 2-satnom vožnjom bicikla visokog intenziteta u 7 treniranih sportaša [13]. U mišiću vastus lateralis, omjer LC3bII/LC3bI smanjio se nakon vježbanja samo u stanju posta (p=0.019) [13], dok su mitohondrijski LC3bII i p62/SQSTM1 ostali nepromijenjeni [13]. Autori su zaključili da mitofagija nije bila aktivirana tijekom ili rano nakon vježbanja bez obzira na nutritivni status, iako se činilo da mišićne stanice u sitom stanju pripremaju mitohondrije za razgradnju u kasnijim vremenskim točkama [13].
Kröpfl i sur. otkrili su da je post od 14 do 15 sati povećao koncentraciju cirkulirajućih autofagijskih monocita (p=0.026), ali ne i limfocita, u usporedbi sa sitim stanjem uz standardizirani doručak [10]. Nasuprot tome, akutno vježbanje povisilo je koncentraciju autofagijskih limfocita (p=0.043), ali ne i monocita [10]. Western blot analiza pokazala je da su viši omjeri LC3BII/I bili u negativnoj korelaciji s brojem autofagijskih stanica (r=-0.74, p=0.02) [10], što ukazuje na složenu regulaciju pri kojoj je povećana autofagija na razini proteina povezana s manjim brojem autofagijskih stanica u cirkulaciji [10].
Produženi post (24+ sata)
Ispitivanja posta u trajanju od 72 sata do 4 dana pružila su dokaze o aktivaciji autofagijskog puta uz trajne interpretacijske izazove. Vendelbo i sur. proučavali su 8 zdravih muškaraca tijekom 72-satnog posta uz dopušten samo unos vode [5]. U biopsijama skeletnih mišića ekspresija LC3B-II porasla je za ~30 %, no protein p62 također je porastao za ~10 % [5]. Fosforilacija mTOR-a smanjila se za ~50 %, uz smanjenu nizvodnu signalizaciju uključujući fosforilaciju 4EBP1, ULK1 i rpS6 [5]. Protuslovni obrasci LC3B-II i p62 učinili su određivanje autofagijskog fluksa problematičnim [5], iako je smanjena mTOR signalizacija podupirala aktivaciju autofagijskog puta. Neto otpuštanje fenilalanina iz mišića značajno se povećalo [5], do čega je došlo u kontekstu smanjenja glukoze za 25 % i inicirane ketogeneze [5].
Bak i sur. usporedili su 12-satni naspram 72-satnog posta u 9 vitkih i 9 pretilih mladih muškaraca [6]. Nakon 72 sata, razine mRNA i proteina ULK1 značajno su porasle u mišićnom i masnom tkivu [6], dok se omjer inhibitorne fosforilacije ULK1 (Ser 757) i ukupnog ULK1 smanjio [6], što ukazuje na smanjenu supresiju autofagije. Međutim, razine mRNA i proteina p62 također su se povećale [6]. Pretili ispitanici pokazali su povećanu lipolizu cijelog tijela i smanjene stope proizvodnje uree, kako bazično tako i nakon 72 sata posta, što je kompatibilno s očuvanjem mišićnih proteina [6]. Ispitivanje je istaknulo ograničenja u izražavanju rezultata po tjelesnoj masi, što potencijalno podcjenjuje metaboličke flukseve kod pretilih ispitanika [6].
Pietrocola i sur. istraživali su četverodnevni post bez unosa kalorija (samo voda, čaj i kava) kod 9 zdravih dobrovoljaca [2]. Post je izazvao značajne promjene u plazmatskom metabolomu, no samo manje promjene u intracelularnom metabolomu leukocita [2]. Bijele krvne stanice pokazale su izraženo smanjenje lizinske acetilacije proteina i u nuklearnim i u citoplazmatskim kompartmentima [2]. Aktivacija autofagije, mjerena lipidacijom LC3B, postala je mjerljiva u neutrofilima tek nakon ex vivo uzgoja s leupeptinom [2], što ukazuje na to da je došlo do autofagijskog fluksa, ali je za detekciju bila potrebna lizosomska inhibicija [2]. Ljudski dobrovoljci zabilježili su gubitak tjelesne mase od <2 % unatoč četverodnevnom postu [2], što je u suprotnosti s gubitkom tjelesne mase od 20 % kod miševa koji su gladovali 48 sati [2].
Dijete koje oponašaju post i ponovno hranjenje
Espinoza i sur. proveli su randomizirano ispitivanje dviju formulacija dijete koja oponaša post (FMD) u usporedbi s kontrolom na 30 zdravih odraslih osoba u dobi od 25 do 65 godina [1]. FMD se sastojao od 1100 kcal 1. dana i 700–800 kcal od 2. do 5. dana, nakon čega je uslijedilo ponovno hranjenje [1]. Korištenjem PBMC-a tretiranih klorokinom za procjenu autofagnog fluksa [1], kontrolna skupina pokazala je više omjere LC3B-II/LC3B-I u odnosu na FMD skupine do 6. dana (p=0,0191) [1], što ukazuje na to da je FMD pojačao autofagnu degradaciju putem povećanog fluksa [1]. Značajne međugrupne razlike u fluksu pojavile su se do kraja 6-dnevne intervencije (p<0,05) [1], s trendom prema povećanom fluksu u skupini ProLon koji je perzistirao 48 sati nakon ponovnog hranjenja 8. dana [1]. Intervencija je smanjila glukozu natašte, inzulin i HOMA-IR uz povećanje β-hidroksibutirata [1], iako su mala veličina uzorka i kratko razdoblje procjene ograničili mogućnost generalizacije [1].
Van Dyck i sur. istraživali su može li 12-satni prekid unosa nutrijenata potaknuti odgovor na post kod 70 dugotrajno kritično oboljelih bolesnika [9]. Randomizirani križni dizajn izmjenjivao je 12 sati ciljane prehrane s 12 sati posta 8. ± 1. dana boravka u ICU-u [9]. 12-satni post značajno je povećao serumski bilirubin i β-hidroksibutirat te smanjio potrebe za inzulinom i serumski IGF-I (sve p≤0,001) [9], potvrđujući pokretanje metaboličkog odgovora na post. Međutim, markeri autofagije u punoj krvi i izoliranim leukocitima ostali su uglavnom nepromijenjeni postom i kod bolesnika i kod 23 usklađena zdrava ispitanika [9]. Autori su zaključili da uzorci krvi možda pouzdano ne odražavaju autofagiju na razini tkiva [9], budući da su tri bolesnika razvila tešku hipoglikemiju tijekom posta [9].
Tkhakushinov i Lysenkov proučavali su djelomičnu deprivaciju hrane (800–1200 kcal/dan) tijekom 12 dana kod 20 muškaraca u tri dobne skupine [14]. Koristeći Beclin-1 kao marker autofagije [14], utvrdili su da je dob vodeći čimbenik koji utječe na aktivnost autofagije, pri čemu se aktivnost smanjivala s porastom dobi [14]. Kategorija tjelesne mase nije značajno utjecala na aktivaciju autofagije tijekom kalorijske restrikcije [14]. Korelacije između aktivnosti autofagije (delta-beclin-1) i parametara metabolizma lipida varirale su ovisno o dobnoj skupini, s negativnim korelacijama s HDL-om kod mlađih odraslih osoba te negativnim korelacijama s LDL-om i ukupnim kolesterolom kod starijih osoba [14]. Studija je mjerila statičku razinu Beclin-1 umjesto fluksa [14].
Interakcije tjelovježbe s postom
Dvije studije iste belgijske skupine istraživale su kako intenzitet tjelovježbe i nutritivni status međusobno djeluju utječući na autofagiju skeletnih mišića. Schwalm i sur. 2015. nasumično su rasporedili 23 dobro trenirana sportaša u kontrolnu skupinu, skupinu niskog intenziteta (55% VO2 peak) ili skupinu visokog intenziteta (70% VO2 peak) tijekom 2-satne vožnje bicikla u stanju sitosti i stanju posta [12]. Intenzitet tjelovježbe pokazao se značajnijim od prehrane u aktivaciji autofagije [12]. Tjelovježba visokog intenziteta smanjila je razine LC3bII i p62/SQSTM1 u mišiću vastus lateralis, što ukazuje na povećani autofagni fluks [12]. Ovo povećanje fluksa bilo je povezano s povećanom aktivnošću AMPKα, što je dokazano višom fosforilacijom AMPKαThr72 i ACCSer79 nakon tjelovježbe visokog intenziteta (p<0.001) [12]. Fosforilacija ULK1Ser317 povećala se nakon tjelovježbe (p<0.001) [12], dok sam post nije značajno pojačao autofagiju u usporedbi s intenzitetom tjelovježbe [12].
Sinteza
Metodološka hijerarhija i mjerenje fluksa
Studije koje koriste validirane testove fluksa pružaju pouzdanije dokaze od onih koje mjere statičke biljege. Tri studije koje primjenjuju lizosomske inhibitore za izravno mjerenje autofagnog fluksa — Espinoza et al., Pietrocola et al. i Singh et al. — predstavljaju metodološki superiornije dizajne [1–4]. Espinoza et al. pokazali su da petodnevna dijeta koja oponaša post pojačava fluks u usporedbi s kontrolnom skupinom [1], dok su Pietrocola et al. pokazali da četverodnevni post aktivira fluks u neutrofilima kada se mjeri na odgovarajući način [2]. Suprotno tome, Singh et al. utvrdili su da 12-satni noćni post praćen ponovnim hranjenjem nije promijenio fluks [3, 4]. Ove studije temeljene na fluksu sugeriraju da je trajanje posta ključno: višednevni postovi aktiviraju mjerljivu autofagiju, dok noćni postovi možda neće proizvesti detektibilne promjene fluksa unutar jednosatnog vremenskog okvira mjerenja nakon ponovnog hranjenja.
Studije koje se oslanjaju na omjere LC3B-II/LC3B-I ili zastupljenost p62 bez procjene fluksa suočavaju se s interpretacijskim ograničenjima. Vendelbo et al. i Bak et al. utvrdili su povećanje LC3B-II uz povećanje p62 tijekom 72-satnog posta [5, 6], što su obrasci za koje su sami autori priznali da sprječavaju konačno određivanje fluksa [5, 6]. Istodobno povećanje oba biljega moglo bi odražavati ili nakupljanje autofagosoma uslijed narušene degradacije ili povećanu sintezu p62 tijekom stresa, a ne povećani fluks. Ovim dvosmislenim nalazima trebalo bi pridati manju težinu u odnosu na izravna mjerenja fluksa pri procjeni učinaka posta na autofagiju.
Tkivno specifični odgovori i biološki kompartmenti
Različita tkiva pokazuju različite autofagne odgovore na post, što objašnjava naizgled proturječne nalaze. Zaključak autora Van Dyck et al. da uzorci krvi možda ne odražavaju autofagiju na razini tkiva [9] u skladu je sa sve većim brojem dokaza o kompartment-specifičnim odgovorima. Studije na skeletnim mišićima (Vendelbo, Bak, Schwalm 2015. i 2017.) dosljedno su pokazale aktivaciju komponenti autofagnog puta, uključujući smanjenu mTOR signalizaciju [5] i povećanu ekspresiju ULK1 [6], čak i kada su mjerenja fluksa bila dvosmislena. Nasuprot tome, studije koje su mjerile autofagiju u cirkulirajućim krvnim stanicama (Van Dyck, Singh et al., Kröpfl) utvrdile su ili izostanak promjena [3, 4, 9] ili odgovore specifične za pojedine tipove stanica, ograničene na određene podskupine leukocita [10].
Nalaz autora Kröpfl et al. da je post povećao autofagne monocite, ali ne i limfocite, dok je tjelovježba povećala autofagne limfocite, ali ne i monocite [10], pokazuje da čak i unutar krvi različiti stanični tipovi različito reagiraju na metaboličke stresore. Pietrocola et al. uočili su aktivaciju autofagije samo u neutrofilima među subpopulacijama leukocita kod dobrovoljaca koji su postili [2]. Ovi tkivno i stanično specifični odgovori sugeriraju da post prvenstveno aktivira autofagiju u metabolički aktivnim tkivima poput mišića, dok krvne stanice, posebice limfociti, mogu biti manje osjetljive na autofagiju induciranu postom.
Vremenska dinamika i trenutak mjerenja
Trenutak mjerenja u odnosu na post i ponovno hranjenje značajno utječe na detektirane promjene autofagije. Chen et al. mjerili su autofagiju u leukocitima nakon 12-satnog noćnog posta i 2 sata nakon doručka [11], utvrdivši da post inducira aktivaciju autofagije kod zdravih ispitanika [11]. Međutim, Singh et al. mjerili su PBMC-e samo 1 sat nakon visokoproteinskog obroka koji je uslijedio nakon 12-satnog posta te nisu zabilježili promjenu fluksa [3, 4], napominjući da uzorkovanje nakon 1 sata možda nije bilo optimalno [4]. Ponovno hranjenje vjerojatno potiskuje autofagiju putem reaktivacije mTOR-a, a kinetika ove supresije može varirati ovisno o tkivu i sastavu nutrijenata.
Studije produljenog posta (72 sata do 4 dana) mjerile su autofagiju na kraju posta bez neposrednog ponovnog hranjenja [2, 5, 6], bilježeći maksimalnu aktivaciju autofagije. Espinoza et al. jedinstveno su mjerili autofagiju tijekom dijete koja oponaša post (4. i 6. dan) te 48 sati nakon ponovnog hranjenja (8. dan) [1], uočivši da je povećani fluks u skupini ProLon pokazao trend perzistencije nakon ponovnog hranjenja [1]. To sugerira da se aktivacija autofagije možda ne poništava trenutno nakon ponovnog hranjenja, no mjerenje nakon 48 sati može odražavati ranu ponovnu supresiju. Studije tjelovježbe (Schwalm 2015. i 2017.) mjerile su mišićne biopsije neposredno i 1 sat nakon vježbanja [12, 13], bilježeći akutne odgovore koji se razlikuju od kroničnih adaptacija na post.
Odnos doze i odgovora: Trajanje posta i magnituda autofagije
Pojavljuje se odnos doze i odgovora u kojem dulje trajanje posta pokazuje jasniju aktivaciju autofagije. Četverodnevni potpuni post (Pietrocola et al.) i petodnevna dijeta koja oponaša post (Espinoza et al.) pokazali su mjerljiva povećanja fluksa [1, 2]. Post u trajanju od 72 sata (Vendelbo, Bak) pokazao je aktivaciju autofagnog puta kroz supresiju mTOR-a i povećanu ekspresiju ULK1 [5, 6], čak i ako je fluks ostao nejasan. Studije noćnog posta u trajanju od 12 do 15 sati dale su varijabilne rezultate: Chen et al. otkrili su aktivaciju kod zdravih ispitanika [11], ali Singh et al. nisu utvrdili promjenu fluksa pri mjerenju nakon ponovnog hranjenja [3, 4], dok su Van Dyck et al. utvrdili da je 12-satni post nedostatan za promjenu biljega autofagije u krvi [9].
Dnevno vremenski ograničeno hranjenje (prozori od 6–8 sati) pokazalo je skromne učinke nakon više dana. Jamshed et al. utvrdili su 22% povećanu ekspresiju LC3A nakon 4 dana sa 6-satnim prozorima hranjenja [7], dok su Karahan et al. utvrdili povećanje ATG-5 nakon 8 tjedana vremenski ograničenog hranjenja 16:8 [8]. Kumulativna izloženost u ovim studijama (ukupno 28 sati posta tijekom 4 dana za Jamshed; 672 sata tijekom 8 tjedana za Karahan) sugerira da ponavljajući dnevni ciklusi posta mogu proizvesti drukčije obrasce autofagije u odnosu na jednokratne produljene postove.
Modulacija metaboličkog konteksta
Metaboličko stanje tijekom posta modulira autofagne odgovore. Studije koje su izvijestile o povišenim ketonima (β-hidroksibutirat) pokazale su istodobnu aktivaciju autofagije: Jamshed et al. utvrdili su povišene jutarnje ketone uz regulaciju LC3A naviše [7], Van Dyck et al. utvrdili su povišeni β-hidroksibutirat od 4. sata posta nadalje uz metabolički odgovor na post [9], a Espinoza et al. utvrdili su povišene ketone uz pojačani autofagni fluks u skupini na dijeti koja oponaša post [1]. Ketoni mogu poslužiti kao biološki biljeg metaboličkog pomaka nužnog za aktivaciju autofagije.
Schwalm et al. 2015 demonstrirali su da intenzitet vježbanja aktivira autofagiju putem putova ovisnih o AMPK neovisno o postu [12]. Tjelovježba visokog intenziteta povećala je fosforilaciju AMPKα i autofagni fluks bez obzira na stanje sitosti ili posta [12], sugerirajući da aktivacija AMPK — bilo energetskim iscrpljivanjem tijekom vježbanja ili uskraćivanjem nutrijenata tijekom posta — predstavlja zajednički mehanizam. Ova mehanistička konvergencija objašnjava zašto tjelovježba i post mogu aktivirati autofagiju putem zajedničkih signalnih putova unatoč različitim okidačima.
Stanje bolesti i početni kapacitet autofagije
Nalaz autora Chen et al. da bolesnici s kroničnom bubrežnom bolešću nisu uspjeli aktivirati autofagiju tijekom noćnog posta, dok su zdravi kontrolni ispitanici pokazali snažnu aktivaciju [11], pokazuje da bolest može poništiti autofagiju induciranu postom. Slično tome, Van Dyck et al. proučavali su kritično oboljele pacijente u ICU-u koji su pokazali minimalne promjene biljega autofagije unatoč metaboličkom odgovoru na post [9]. To sugerira da teška bolest narušava stanični kapacitet za indukciju autofagije, potencijalno putem upale, oksidativnog stresa ili metaboličke disfunkcije. Bak et al. utvrdili su da pretili ispitanici imaju nižu ekspresiju proteina povezanih s autofagijom u masnom tkivu unatoč višoj ukupnoj lipolizi [6], što ukazuje na to da pretilost može otupiti autofagne odgovore na razini tkiva čak i kada metabolizam cijelog tijela odgovara na post.
Razmatranja o kvaliteti studija
Randomizirani križni dizajni u kojima sudionici služe kao vlastita kontrola (Jamshed, Schwalm 2015 and 2017, Vendelbo, Bak) minimiziraju interindividualnu varijabilnost i pružaju snažnije dokaze od jednostrukih prije-poslije studija (Singh 2024 and 2025, Tkhakushinov) ili dizajna parova slučaj-kontrola (Chen) [3–7, 11–14]. Međutim, čak i dobro dizajnirane križne studije koje koriste statičke biljege suočavaju se s interpretacijskim ograničenjima u usporedbi sa studijama koje mjere fluks pomoću lizosomskih inhibitora. Randomizirano ispitivanje autora Espinoza et al., unatoč maloj veličini uzorka i industrijskom sponzorstvu (iako financijeri nisu sudjelovali u provođenju ili analizi) [1], pruža visokokvalitetne podatke o fluksu uz primjenu validirane metodologije.
Integracija i kliničke implikacije
Sintetizirajući ove čimbenike, dokazi sugeriraju da višednevni post (≥72 sata) ili dijete koje oponašaju post aktiviraju autofagiju u metabolički aktivnim tkivima, posebice u skeletnim mišićima, s mjerljivim povećanjima fluksa kada se procjenjuju odgovarajućim metodama. Ova aktivacija zahtijeva dostatno trajanje kako bi se inducirali metabolički pomaci, uključujući ketogenezu i znatnu supresiju mTOR-a. Kraća razdoblja dnevnog posta (12–15 sati) pokazuju nedosljedne učinke na autofagiju, vjerojatno zbog trenutka mjerenja u odnosu na ponovno hranjenje, ispitivanog tkiva i individualnih varijacija u metaboličkoj fleksibilnosti. Krvne stanice, posebice limfociti, čine se manje responzivnima na autofagiju induciranu postom od mišića ili specifičnih populacija monocita. Stanja bolesti, uključujući kroničnu bubrežnu bolest i kritična stanja, mogu poništiti ili znatno otupiti odgovore autofagije na post.
Kliničke studije na ljudima koje mjere autofagiju validiranim testovima fluksa i dalje su rijetke, što ograničava donošenje konačnih zaključaka o optimalnim protokolima posta za indukciju autofagije. Nesklad između pretkliničkih modela koji pokazuju snažnu aktivaciju autofagije i studija na ljudima koje pokazuju skromne ili odsutne promjene upućuje na međuvrsne razlike u regulaciji autofagije ili naglašava ograničenja trenutnih tehnika mjerenja kod ljudi. Buduća istraživanja zahtijevaju standardizirane protokole mjerenja fluksa, procjene specifične za pojedina tkiva i pažljivo praćenje vremena mjerenja u odnosu na cikluse posta i ponovnog hranjenja.
