Risposte dell'autofagia e del flusso autofagico umano agli interventi di digiuno: evidenze e sfumature metodologiche

Negli adulti, quali evidenze dirette dimostrano che l'alimentazione a restrizione temporale, il digiuno intermittente, il digiuno prolungato o la successiva realimentazione alterano l'autofagia o il flusso autofagico nei tessuti o nelle cellule umane, e quanto sono solide tali evidenze?

La misurazione diretta del flusso autofagico nell'uomo dimostra che il digiuno di più giorni (3-5 giorni) attiva l'autofagia nei tessuti metabolicamente attivi come il muscolo scheletrico e specifiche popolazioni di cellule immunitarie, ma l'alimentazione quotidiana a restrizione temporale e il digiuno notturno producono effetti incoerenti o minimi che variano sostanzialmente in base al tipo di tessuto, al metodo di misurazione e allo stato di salute individuale, con le evidenze più solide derivanti da studi che impiegano inibitori lisosomiali per misurare il flusso piuttosto che l'abbondanza statica dei marcatori.

Abstract

Quattordici studi che hanno esaminato le risposte autofagiche agli interventi di digiuno negli adulti rivelano una qualità eterogenea delle evidenze e risposte tessuto-specifiche. Gli studi che utilizzano saggi validati del flusso autofagico con inibitori lisosomiali forniscono le evidenze più solide: una dieta mima-digiuno di 5 giorni ha aumentato il flusso autofagico nelle cellule mononucleate del sangue periferico rispetto ai controlli (p=0.0191) [1], e un digiuno completo di 4 giorni ha attivato il flusso nei neutrofili se misurato in modo appropriato [2]. Al contrario, un digiuno notturno di 12 ore seguito da rialimentazione non ha alterato il flusso in due studi condotti su 42 adulti sani [3, 4]. Il digiuno prolungato (72 ore) ha costantemente attivato i componenti della via autofagica nel muscolo scheletrico, inclusa una riduzione di circa il 50% della fosforilazione di mTOR [5] e un aumento dell'espressione di ULK1 [6], sebbene le misurazioni dei marcatori statici che mostrano aumenti simultanei di LC3B-II e p62 abbiano impedito una determinazione definitiva del flusso [5, 6]. L'alimentazione a restrizione temporale giornaliera (finestre di 6-8 ore) ha prodotto effetti modesti da 4 giorni a 8 settimane, aumentando l'espressione di LC3A del 22% [7] e i livelli di ATG-5 [8]. Sono emerse risposte tessuto-specifiche, con i marcatori di autofagia ematici ampiamente non influenzati dal digiuno di 12 ore nei pazienti critici e nei controlli sani [9], mentre il digiuno ha aumentato i monociti autofagici ma non i linfociti [10]. L'insufficienza renale cronica ha annullato l'attivazione dell'autofagia osservata nei soggetti sani durante il digiuno notturno (rapporto γLC3 0.92 vs 1.78, p<0.0001) [11]. L'intensità dell'esercizio fisico si è dimostrata più determinante dello stato di digiuno nell'attivare l'autofagia del muscolo scheletrico attraverso vie AMPK-dipendenti [12]. Le evidenze suggeriscono che il digiuno di più giorni attiva l'autofagia nei tessuti metabolicamente attivi se misurato con metodi di flusso validati, mentre periodi di digiuno giornalieri più brevi mostrano effetti non uniformi che variano in base al tipo di tessuto, alla tempistica di misurazione e alla capacità metabolica individuale.

Diagramma di flusso

Ricerca bibliografica

Corpus PubMed

Abbiamo condotto una ricerca per parole chiave all'interno del corpus PubMed.

(autophagy OR autophagic flux OR LC3 OR SQSTM1 OR p62 OR ULK1 OR Beclin-1 OR ATG) AND (fasting OR starvation OR "time-restricted eating" OR "time restricted feeding" OR intermittent fasting) AND humans

La ricerca ha restituito un totale di 300 risultati da PubMed.

Corpus Elicit

Abbiamo condotto una ricerca semantica su oltre 138 milioni di pubblicazioni scientifiche tramite il motore di ricerca Elicit, che include l'intero corpus di Semantic Scholar e OpenAlex.

Abbiamo eseguito le seguenti query:

• "human fasting skeletal muscle blood leukocyte PBMC autophagy LC3 p62"
• "prolonged fasting refeeding human autophagy autophagic flux biomarker study"

Le ricerche hanno restituito un totale di 600 risultati da Elicit.

Abbiamo recuperato per lo screening i 794 articoli maggiormente pertinenti alla query.

Screening

Screening degli abstract

Abbiamo selezionato le fonti sulla base dei rispettivi abstract che soddisfacevano i seguenti criteri:

• Adulti umani: Il titolo o l'abstract riportano uno studio condotto su adulti umani (età pari o superiore a 18 anni) o su una coorte umana di età mista che possa plausibilmente includere adulti?
• Studio primario completato: Si tratta del report primario di uno studio clinico completato sull'uomo, anziché di una review, un protocollo, un design paper, un editoriale, un erratum o un abstract congressuale?
• Esposizione al digiuno: Il titolo o l'abstract valutano un'esposizione definita a digiuno, time-restricted eating/feeding, digiuno intermittente, digiuno a giorni alterni o rialimentazione post-digiuno?
• Outcome correlato all'autofagia: Il titolo o l'abstract indicano la misurazione dell'autofagia, del flusso autofagico o di un marcatore molecolare/cellulare correlato all'autofagia?

Gli articoli che non hanno soddisfatto anche un solo criterio vincolante sono stati automaticamente esclusi. Per gli articoli rimanenti, abbiamo valutato congiuntamente tutte le domande di screening formulando un giudizio olistico sull'opportunità di includere ciascun articolo.

36 articoli hanno superato lo screening degli abstract e sono passati allo screening del testo completo.

In fase di screening degli abstract, il numero di articoli esclusi per ciascun motivo principale è stato:

• Adulti umani: n = 463
• Studio primario completato: n = 67
• Esposizione al digiuno: n = 144
• Outcome correlato all'autofagia: n = 82
• Altro / al di sotto della soglia di screening: n = 2

Screening del testo completo

Abbiamo quindi esaminato gli articoli sulla base del testo completo applicando i seguenti criteri aggiuntivi:

• Dati su adulti umani: Includere esclusivamente pubblicazioni con dati analizzabili relativi ad adulti di età pari o superiore a 18 anni.
• Esposizione definita: Includere esclusivamente studi con un'esposizione a digiuno o rialimentazione sufficientemente descritta, compresa la durata o la finestra di alimentazione giornaliera.
• Misurazione diretta dell'autofagia: Includere esclusivamente studi che misurano direttamente l'autofagia o il flusso autofagico in un campione biologico umano, utilizzando almeno un marcatore molecolare, proteico, di imaging o lisosomiale/autofagosomiale. Escludere gli studi con soli outcome metabolici, infiammatori, di longevità o clinici.
• Report primario completato: Includere esclusivamente report di ricerca primaria completati e corredati di risultati, escludendo review, protocolli, articoli narrativi e abstract congressuali.

Gli articoli che non hanno soddisfatto anche un solo criterio vincolante sono stati automaticamente esclusi. Per gli articoli rimanenti, abbiamo valutato congiuntamente tutte le domande di screening formulando un giudizio olistico sull'opportunità di includere ciascun articolo nell'analisi finale.

14 articoli hanno superato lo screening del testo completo e sono passati all'estrazione dei dati.

In fase di screening del testo completo, il numero di articoli esclusi per ciascun motivo principale è stato:

• Dati su adulti umani: n = 1
• Esposizione definita: n = 1
• Misurazione diretta dell'autofagia: n = 4
• Testo completo non disponibile: n = 16

Estrazione dei dati

Abbiamo richiesto a un large language model di estrarre ciascuna delle colonne di dati sottostanti da ogni articolo. Al modello sono state fornite le istruzioni di estrazione indicate di seguito per ciascuna colonna.

• Identità e disegno dello studio: Estrarre citazione, paese se riportato, disegno dello studio (randomizzato, crossover, alimentazione controllata, prospettico meccanicistico o altro), dimensione del campione analizzato e caratteristiche della popolazione.
• Esposizione e comparatore: Estrarre con precisione il regime di digiuno: finestra di alimentazione giornaliera, durata del digiuno, apporto energetico consentito, numero di cicli/giorni, indicazioni sull'attività fisica e comparatore o baseline.
• Campione biologico e tempistiche: Estrarre tipo di campione/tessuto/cellula, tempistica di prelievo rispetto all'ultimo apporto calorico e alla rialimentazione, ed eventuale esecuzione di campionamenti ripetuti intra-individuali.
• Misurazione dell'autofagia e interpretabilità: Estrarre ciascun saggio/marcatore correlato all'autofagia, specificando se valuta il flusso rispetto a un indicatore statico di abbondanza/espressione, la direzione della variazione e i limiti del saggio dichiarati dagli autori.
• Risultati primari sull'autofagia: Estrarre i risultati numerici ove disponibili, l'incertezza/il test statistico e le conclusioni degli autori in merito all'autofagia.
• Contesto metabolico e sicurezza: Estrarre chetoni, glucosio, insulina, variazione ponderale, eventi avversi e interruzioni solo se riportati.
• Indicatori del rischio di bias: Estrarre le caratteristiche metodologiche rilevanti per il bias: allocazione/randomizzazione, controllo/comparatore, accecamento degli outcome di laboratorio, dati mancanti, pre-specificazione e conflitti di interesse.

Risultati

Caratteristiche degli studi inclusi

Sono stati inclusi quattordici studi che hanno esaminato l'autofagia in risposta al digiuno o all'alimentazione a tempo limitato. I testi completi sono stati recuperati per tutti gli studi. Le dimensioni del campione variavano da 7 a 70 partecipanti, con la maggior parte degli studi condotti su adulti sani. Gli studi sono stati condotti principalmente in Europa (Belgio, Danimarca) e negli Stati Uniti, con ulteriori studi provenienti da Taiwan e Russia. I disegni di studio includevano trial crossover randomizzati, studi con alimentazione controllata e studi prospettici meccanicistici.

Gli studi hanno esaminato diversi regimi di digiuno, dai digiuni notturni di 8 ore ai digiuni completi di 4 giorni, con misurazioni effettuate in vari tessuti tra cui muscolo scheletrico, cellule del sangue e cellule mononucleate del sangue periferico. La maggior parte degli studi ha impiegato disegni crossover in cui i partecipanti fungevano da controlli di se stessi, con misurazioni prima e dopo gli interventi di digiuno.

Metodi di misurazione dell'autofagia e interpretabilità

Gli studi hanno impiegato metodi di analisi eterogenei con una diversa capacità di distinguere il flusso autofagico dall'abbondanza statica dei marcatori. Il processamento di LC3 (microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3) è stato il marcatore più comunemente riportato, valutato mediante i rapporti LC3B-II/LC3B-I [1, 5, 10, 13], la lipidazione di LC3 [2] o l'espressione genica di LC3A/LC3B [7]. Ulteriori marcatori includevano p62/SQSTM1 (sequestosome 1) [5, 12, 13], la fosforilazione di ULK1 (unc-51 like autophagy activating kinase 1) [5, 6, 12], le proteine ATG (autophagy-related) [8], Beclin-1 [8, 11, 14] e la segnalazione di mTOR (mechanistic target of rapamycin) [5].

Sono emerse distinzioni metodologiche critiche per quanto riguarda le misurazioni del flusso rispetto a quelle statiche. Diversi studi hanno misurato il flusso autofagico utilizzando inibitori lisosomiali: Espinoza et al. hanno trattato le PBMC con clorochina ex vivo, misurando l'accumulo di LC3B-II come indicatore convalidato del flusso [1]. Analogamente, Pietrocola et al. hanno iniettato leupeptin prima del prelievo ematico nei topi e hanno coltivato leucociti umani ex vivo con leupeptin, riscontrando un'attivazione dell'autofagia rilevabile solo con l'inibizione delle proteasi [2]. Singh et al. 2024 e 2025 hanno aggiunto inibitori lisosomiali direttamente al sangue intero, quantificando l'accumulo di LC3B-II tramite ELISA come misura fisiologicamente rilevante del flusso [3, 4]. Al contrario, la maggior parte degli studi ha misurato l'abbondanza statica dei marcatori di autofagia senza valutazione del flusso, determinando criticità interpretative.

Il rapporto LC3B-II/LC3B-I esemplifica questa limitazione. Sebbene comunemente utilizzato come indicatore di autofagia, un valore elevato di LC3B-II può riflettere sia un aumento della formazione di autofagosomi sia una compromissione della loro degradazione [5]. Vendelbo et al. hanno riscontrato che LC3B-II aumentava di circa il 30% durante un digiuno di 72 ore, ma anche p62 aumentava di circa il 10%, complicando l'interpretazione poiché p62 viene tipicamente degradato durante l'autofagia [5]. Gli autori hanno sottolineato di non poter determinare in modo definitivo il flusso autofagico da questi marcatori contrastanti [5]. Bak et al. hanno riportato quadri simili: ULK1 aumentava e la sua fosforilazione inibitoria diminuiva con il digiuno, suggerendo l'attivazione dell'autofagia, eppure anche l'mRNA e la proteina p62 aumentavano [6]. Entrambi gli studi hanno riconosciuto che questi dati non misurano direttamente il flusso [5, 6].

Gli studi che hanno utilizzato marcatori complementari hanno fornito prove più solide. Schwalm et al. 2015 hanno misurato la fosforilazione di ULK1, il rapporto LC3bII/I, la proteina p62/SQSTM1 e l'espressione di geni correlati all'autofagia, riscontrando una riduzione di LC3bII e p62 dopo un esercizio ad alta intensità, indicando un aumento del flusso [12]. La diminuzione dei livelli di entrambi i marcatori, anziché di uno solo, ha dimostrato in modo più convincente la degradazione autofagica. Analogamente, Kröpfl et al. hanno combinato la citometria a flusso per le cellule LC3B-positive con il Western blotting per i rapporti LC3BII/I, riscontrando tuttavia una correlazione negativa tra queste misure nei monociti [10], suggerendo una regolazione complessa non pienamente catturata da singoli marcatori.

Diversi studi hanno evidenziato risposte autofagiche tessuto-specifiche. Van Dyck et al. hanno rilevato che i marcatori di autofagia nei campioni di sangue erano ampiamente inalterati da 12 ore di digiuno in pazienti critici e controlli sani, portando gli autori a concludere che il sangue potrebbe non riflettere l'autofagia in altri tessuti [9]. Kröpfl et al. hanno osservato risposte differenziali nei linfociti rispetto ai monociti: il digiuno ha aumentato le concentrazioni di monociti autofagici ma non di linfociti, mentre l'esercizio ha aumentato i linfociti autofagici ma non i monociti [10]. Chen et al. hanno dimostrato che il digiuno notturno ha attivato l'autofagia nei leucociti di soggetti sani ma non nei pazienti con insufficienza renale cronica [11], indicando che lo stato patologico può annullare le tipiche risposte autofagiche.

I limiti dichiarati dagli autori hanno confermato queste difficoltà metodologiche. Molteplici studi hanno osservato che l'espressione genica potrebbe non riflettere i livelli proteici o l'attività funzionale [7], singoli time point possono non cogliere le variazioni dinamiche [4] e l'autofagia nel sangue potrebbe non rappresentare le risposte nei tessuti metabolicamente attivi come fegato o muscolo [4, 9]. Espinoza et al. hanno citato la ridotta dimensione campionaria e il breve periodo di valutazione come limiti [1], mentre Karahan et al. hanno evidenziato che la valutazione isolata di ATG-5 e Beclin-1, senza la determinazione di p62/SQSTM1, limitava l'interpretazione del flusso autofagico [8].

Risultati sull'autofagia in base all'esposizione al digiuno

Alimentazione a tempo limitato (finestre di alimentazione giornaliere)

Due studi hanno esaminato l'alimentazione a tempo limitato giornaliera con finestre di alimentazione di 6-8 ore. Jamshed et al. hanno scoperto che l'alimentazione precoce a tempo limitato (eTRF; 8:00-14:00, finestra di 6 ore) ha aumentato l'espressione genica di LC3A del 22% al mattino rispetto a una finestra di controllo di 12 ore (8:00-20:00), con p=0.001 [7]. Questo aumento si è verificato nelle cellule del sangue intero dopo 4 giorni di eTRF [7]. Tuttavia, LC3A è un marcatore statico di espressione genica piuttosto che una misura diretta del flusso [7], e gli autori hanno osservato che l'espressione genica potrebbe non riflettere i livelli proteici [7]. Il quadro metabolico includeva una diminuzione dei livelli di glucosio nelle 24 ore di 4±1 mg/dL (p=0.0003) e un aumento dei chetoni mattutini di 0.03±0.01 mM (p=0.009) [7].

Karahan et al. hanno confrontato la sola restrizione energetica rispetto alla restrizione energetica combinata con un'alimentazione a tempo limitato 16:8 (finestra di alimentazione 10:00-20:00) in 48 adulti con steatosi epatica associata a disfunzione metabolica [8]. I livelli di ATG-5 sono aumentati significativamente solo nel gruppo a tempo limitato dopo 8 settimane, da 0.74 a 0.95 ng/mL (p=0.03) [8], con una correlazione positiva tra FGF-21 sierico e ATG-5 (R=0.343, p=0.02) [8]. ATG-5 rappresenta un marcatore sierico statico [8], e lo studio ha riconosciuto limitazioni nella valutazione del flusso in assenza dell'analisi di p62/SQSTM1 [8]. Entrambi i gruppi hanno mostrato una perdita di peso e un miglioramento dei marcatori metabolici, inclusa la riduzione della glicemia a digiuno e degli enzimi epatici [8].

Digiuno intermittente e digiuni notturni

Gli studi sui digiuni notturni di 8-15 ore hanno rivelato risposte autofagiche tessuto-specifiche e contesto-dipendenti. Chen et al. hanno dimostrato che un digiuno notturno di 12 ore ha indotto l'attivazione dell'autofagia in soggetti sani, come indicato dalla conversione da LC3-I a LC3-II (rapporto γLC3 di 1.78) e dall'aumento dell'mRNA di Atg5 e Beclin-1 [11]. Questa risposta era assente nei pazienti con malattia renale cronica (rapporto γLC3 0.92-1.22, p<0.0001) [11], e l'emodialisi non ha ripristinato l'attivazione dell'autofagia [11]. Le misurazioni sono state effettuate nei leucociti raccolti dopo il digiuno notturno e 2 ore dopo la colazione [11].

Due studi di Singh et al. hanno esaminato se un pasto ad alto contenuto proteico dopo 12 ore di digiuno notturno alterasse l'autofagia in 42 adulti sani. Utilizzando il test ELISA potenziato con inibitori lisosomiali per misurare il flusso autofagico nelle PBMC [3, 4], entrambi gli studi non hanno riscontrato alcuna variazione del flusso tra lo stato di digiuno e 1 ora dopo il consumo del pasto [3, 4]. Gli autori hanno osservato che ciò mette in discussione l'ipotesi che gli interventi nutrizionali acuti alterino l'autofagia negli esseri umani [4] e hanno suggerito che il campionamento a 1 ora dopo il pasto potrebbe non aver rappresentato la tempistica ottimale [4]. In particolare, i soggetti di sesso femminile presentavano un flusso autofagico superiore rispetto a quelli di sesso maschile (p=0.0031) [3], evidenziando un dimorfismo sessuale indipendente dall'intervento nutrizionale.

Schwalm et al. 2017 hanno esaminato 8 ore di digiuno notturno combinate con 2 ore di ciclismo ad alta intensità in 7 atleti allenati [13]. Nel muscolo vasto laterale, il rapporto LC3bII/LC3bI è diminuito post-esercizio solo nello stato di digiuno (p=0.019) [13], mentre LC3bII mitocondriale e p62/SQSTM1 sono rimasti invariati [13]. Gli autori hanno concluso che la mitofagia non è stata attivata durante o subito dopo l'esercizio, indipendentemente dallo stato nutrizionale, sebbene le cellule muscolari nello stato nutrito sembrassero preparare i mitocondri per la degradazione in momenti successivi [13].

Kröpfl et al. hanno riscontrato che un digiuno di 14-15 ore ha aumentato le concentrazioni di monociti autofagici circolanti (p=0.026), ma non quelle dei linfociti, rispetto a una condizione nutrita con colazione standardizzata [10]. Al contrario, l'esercizio acuto ha incrementato le concentrazioni di linfociti autofagici (p=0.043), ma non quelle dei monociti [10]. L'analisi Western blot ha mostrato che rapporti LC3BII/I più elevati correlavano negativamente con il numero di cellule autofagiche (r=-0.74, p=0.02) [10], suggerendo una regolazione complessa in cui un'aumentata autofagia a livello proteico era associata a un minor numero di cellule autofagiche in circolo [10].

Digiuno prolungato (24+ ore)

Gli studi sui digiuni da 72 ore a 4 giorni hanno fornito evidenze dell'attivazione della via autofagica, pur presentando persistenti sfide interpretative. Vendelbo et al. hanno studiato 8 soggetti maschi sani durante un digiuno di 72 ore con la sola assunzione di acqua consentita [5]. Nelle biopsie di muscolo scheletrico, l'espressione di LC3B-II è aumentata di ~30%, ma anche la proteina p62 è aumentata di ~10% [5]. La fosforilazione di mTOR è diminuita di ~50%, insieme a una ridotta segnalazione a valle che include la fosforilazione di 4EBP1, ULK1 e rpS6 [5]. I pattern contrastanti di LC3B-II e p62 hanno reso problematica la determinazione del flusso autofagico [5], sebbene la ridotta segnalazione di mTOR abbia supportato l'attivazione della via autofagica. Il rilascio netto muscolare di fenilalanina è aumentato significativamente [5], manifestandosi in un contesto di riduzione del glucosio del 25% e di chetogenesi avviata [5].

Bak et al. hanno confrontato il digiuno di 12 ore rispetto a quello di 72 ore in 9 giovani uomini normopeso e 9 obesi [6]. Dopo 72 ore, i livelli proteici e di mRNA di ULK1 sono aumentati significativamente nel muscolo e nel tessuto adiposo [6], mentre il rapporto tra la fosforilazione inibitoria di ULK1 (Ser 757) e ULK1 totale è diminuito [6], indicando una minore soppressione dell'autofagia. Tuttavia, anche i livelli proteici e di mRNA di p62 sono aumentati [6]. I soggetti obesi hanno mostrato un incremento della lipolisi corporea totale e una riduzione dei tassi di produzione di urea sia a livello basale sia dopo 72 ore di digiuno, dato compatibile con la preservazione delle proteine muscolari [6]. Lo studio ha rilevato limiti nell'esprimere i risultati per peso corporeo, sottostimando potenzialmente i flussi metabolici nei soggetti obesi [6].

Pietrocola et al. hanno esaminato un digiuno a zero calorie di 4 giorni (consentiti solo acqua, tè e caffè) in 9 volontari sani [2]. Il digiuno ha indotto importanti cambiamenti nel metaboloma plasmatico, ma solo alterazioni minori nel metaboloma intracellulare dei leucociti [2]. I globuli bianchi hanno mostrato una marcata riduzione dell'acetilazione della lisina proteica sia nel compartimento nucleare che in quello citoplasmatico [2]. L'attivazione dell'autofagia, misurata mediante la lipidazione di LC3B, è diventata rilevabile nei neutrofili solo dopo coltura ex vivo con leupeptina [2], indicando che il flusso autofagico si è verificato ma ha richiesto l'inibizione lisosomiale per essere rilevato [2]. I volontari umani hanno registrato una perdita di peso <2% nonostante il digiuno di 4 giorni [2], a fronte di una perdita di peso del 20% riscontrata nei topi a digiuno per 48 ore [2].

Diete mima-digiuno e rialimentazione

Espinoza et al. hanno condotto uno studio randomizzato su due formulazioni di dieta mima-digiuno (FMD) rispetto al controllo in 30 adulti sani di età compresa tra 25 e 65 anni [1]. La FMD consisteva in 1100 kcal il giorno 1 e 700-800 kcal nei giorni 2-5, seguiti da rialimentazione [1]. Utilizzando PBMCs trattati con clorochina per valutare il flusso autofagico [1], il gruppo di controllo ha mostrato rapporti LC3B-II/LC3B-I più elevati rispetto ai gruppi FMD entro il giorno 6 (p=0.0191) [1], indicando che la FMD ha potenziato la degradazione autofagica attraverso un incremento del flusso [1]. Significative differenze intergruppo nel flusso sono emerse al termine dell'intervento di 6 giorni (p<0.05) [1], con una tendenza verso un aumento del flusso nel gruppo ProLon che è persistita 48 ore dopo la rialimentazione al giorno 8 [1]. L'intervento ha ridotto la glicemia a digiuno, l'insulina e l'HOMA-IR, aumentando al contempo il β-hydroxybutyrate [1], sebbene la ridotta dimensione del campione e il breve periodo di valutazione abbiano limitato la generalizzabilità [1].

Van Dyck et al. hanno valutato se un'interruzione dell'apporto nutrizionale di 12 ore potesse innescare una risposta al digiuno in 70 pazienti con patologia critica prolungata [9]. Il disegno crossover randomizzato ha alternato 12 ore di nutrizione mirata al target con 12 ore di digiuno al giorno 8±1 di degenza in ICU [9]. Il digiuno di 12 ore ha aumentato significativamente la bilirubina sierica e il β-hydroxybutyrate e ha ridotto il fabbisogno di insulina e l'IGF-I sierico (tutti p≤0.001) [9], confermando l'innesco della risposta metabolica al digiuno. Tuttavia, i marcatori di autofagia nel sangue intero e nei leucociti isolati sono rimasti ampiamente inalterati dal digiuno sia nei pazienti sia in 23 soggetti sani appaiati [9]. Gli autori hanno concluso che i campioni ematici potrebbero non riflettere in modo affidabile l'autofagia a livello tissutale [9], rilevando inoltre che tre pazienti hanno sviluppato ipoglicemia severa durante il digiuno [9].

Tkhakushinov & Lysenkov hanno esaminato la privazione parziale di cibo (800-1200 kcal/day) per 12 giorni in 20 uomini suddivisi in tre fasce di età [14]. Utilizzando Beclin-1 come marcatore di autofagia [14], hanno rilevato che l'età rappresentava il fattore principale nell'influenzare l'attività autofagica, con una diminuzione dell'attività all'aumentare dell'età [14]. La categoria di peso non ha influenzato significativamente l'attivazione dell'autofagia durante la restrizione calorica [14]. Le correlazioni tra l'attività autofagica (delta-beclin-1) e i parametri del metabolismo lipidico variavano in base alla fascia di età, evidenziando correlazioni negative con HDL nei giovani adulti e correlazioni negative con LDL e colesterolo totale negli anziani [14]. Lo studio ha misurato l'abbondanza statica di Beclin-1 piuttosto che il flusso [14].

Interazioni tra esercizio fisico e digiuno

Due studi condotti dallo stesso gruppo belga hanno esaminato come l'intensità dell'esercizio fisico e lo stato nutrizionale interagiscano nell'influenzare l'autofagia del muscolo scheletrico. Schwalm et al. 2015 hanno randomizzato 23 atleti ben allenati a 2 ore di ciclismo di controllo, a bassa intensità (55% VO2 peak) o ad alta intensità (70% VO2 peak), sia in stato nutrito che a digiuno [12]. L'intensità dell'esercizio si è rivelata più significativa rispetto alla dieta nell'attivare l'autofagia [12]. L'esercizio ad alta intensità ha ridotto i livelli di LC3bII e p62/SQSTM1 nel muscolo vastus lateralis, indicando un aumento del flusso autofagico [12]. Questo incremento del flusso è risultato associato a una maggiore attività di AMPKα, come evidenziato da una superiore fosforilazione di AMPKαThr72 e ACCSer79 dopo l'esercizio ad alta intensità (p<0.001) [12]. La fosforilazione di ULK1Ser317 è aumentata dopo l'esercizio (p<0.001) [12], mentre il digiuno da solo non ha incrementato significativamente l'autofagia rispetto all'intensità dell'esercizio [12].

Sintesi

Gerarchia metodologica e misurazione del flusso

Gli studi che utilizzano saggi di flusso convalidati forniscono evidenze più affidabili rispetto a quelli che misurano marcatori statici. I tre studi che impiegano inibitori lisosomiali per misurare direttamente il flusso autofagico—Espinoza et al., Pietrocola et al. e Singh et al.—rappresentano disegni metodologicamente superiori [1–4]. Espinoza et al. hanno dimostrato che una dieta mima-digiuno di 5 giorni ha potenziato il flusso rispetto ai controlli [1], mentre Pietrocola et al. hanno mostrato che un digiuno di 4 giorni ha attivato il flusso nei neutrofili se misurato adeguatamente [2]. Al contrario, Singh et al. hanno rilevato che un digiuno notturno di 12 ore seguito da realimentazione non ha alterato il flusso [3, 4]. Questi studi basati sul flusso suggeriscono che la durata del digiuno sia fondamentale: i digiuni prolungati di più giorni attivano un'autofagia misurabile, mentre i digiuni notturni potrebbero non produrre variazioni rilevabili del flusso all'interno della finestra di misurazione a 1 ora post-realimentazione.

Gli studi che si basano sui rapporti LC3B-II/LC3B-I o sull'abbondanza di p62 senza una valutazione del flusso presentano limiti interpretativi. Vendelbo et al. e Bak et al. hanno entrambi riscontrato un aumento di LC3B-II unitamente a un incremento di p62 durante un digiuno di 72 ore [5, 6], pattern che gli autori hanno riconosciuto impedire una determinazione definitiva del flusso [5, 6]. L'aumento simultaneo di entrambi i marcatori potrebbe riflettere o un accumulo di autofagosomi dovuto a una degradazione compromessa o un incremento della sintesi di p62 durante lo stress, piuttosto che un aumento del flusso. Questi risultati ambigui dovrebbero avere un peso inferiore rispetto alle misurazioni dirette del flusso nel valutare gli effetti del digiuno sull'autofagia.

Risposte tessuto-specifiche e compartimenti biologici

Tessuti diversi mostrano risposte autofagiche distinte al digiuno, spiegando risultati apparentemente contraddittori. La conclusione di Van Dyck et al. secondo cui i campioni ematici potrebbero non riflettere l'autofagia a livello tissutale [9] è in linea con le crescenti evidenze di risposte compartimento-specifiche. Gli studi sul muscolo scheletrico (Vendelbo, Bak, Schwalm 2015 e 2017) hanno costantemente mostrato l'attivazione di componenti della via autofagica, tra cui una ridotta segnalazione di mTOR [5] e un'aumentata espressione di ULK1 [6], anche quando le misurazioni del flusso risultavano ambigue. Al contrario, gli studi che hanno misurato l'autofagia nelle cellule ematiche circolanti (Van Dyck, Singh et al., Kröpfl) non hanno rilevato variazioni [3, 4, 9] oppure hanno evidenziato risposte specifiche per tipo cellulare limitate a particolari sottopopolazioni leucocitarie [10].

La scoperta di Kröpfl et al. secondo cui il digiuno ha aumentato i monociti autofagici ma non i linfociti, mentre l'esercizio fisico ha aumentato i linfociti autofagici ma non i monociti [10], dimostra che, persino nel sangue, tipi cellulari differenti rispondono in modo distinto agli stressor metabolici. Pietrocola et al. hanno osservato l'attivazione dell'autofagia esclusivamente nei neutrofili tra le sottopopolazioni leucocitarie di volontari a digiuno [2]. Queste risposte tessuto- e tipo cellulare-specifiche suggeriscono che il digiuno attivi l'autofagia preferenzialmente nei tessuti metabolicamente attivi come il muscolo, mentre le cellule del sangue, in particolare i linfociti, potrebbero essere meno sensibili all'autofagia indotta dal digiuno.

Dinamica temporale e tempistica di misurazione

La tempistica delle misurazioni rispetto al digiuno e alla realimentazione influisce in modo sostanziale sulle variazioni di autofagia rilevate. Chen et al. hanno misurato l'autofagia nei leucociti sia dopo un digiuno notturno di 12 ore sia 2 ore post-colazione [11], rilevando che il digiuno induceva l'attivazione dell'autofagia nei soggetti sani [11]. Tuttavia, Singh et al. hanno misurato i PBMC solo 1 ora dopo un pasto iperproteico successivo a 12 ore di digiuno, non riscontrando alcuna variazione del flusso [3, 4] e osservando che il campionamento a 1 ora potrebbe non essere stato ottimale [4]. La realimentazione sopprime verosimilmente l'autofagia attraverso la riattivazione di mTOR, e la cinetica di questa soppressione può variare in base al tessuto e alla composizione dei nutrienti.

Gli studi sul digiuno prolungato (da 72 ore a 4 giorni) hanno misurato l'autofagia al termine del digiuno senza realimentazione immediata [2, 5, 6], rilevando la massima attivazione autofagica. Espinoza et al. hanno misurato in modo peculiare l'autofagia durante la dieta mima-digiuno (giorni 4 e 6) e 48 ore dopo la realimentazione (giorno 8) [1], osservando che l'aumento del flusso nel gruppo ProLon mostrava una tendenza alla persistenza dopo la realimentazione [1]. Ciò suggerisce che l'attivazione dell'autofagia potrebbe non invertirsi immediatamente con la realimentazione, sebbene la misurazione a 48 ore possa riflettere una precoce risoppressione. Gli studi sull'esercizio fisico (Schwalm 2015 e 2017) hanno analizzato biopsie muscolari immediatamente e 1 ora post-esercizio [12, 13], catturando risposte acute che differiscono dagli adattamenti al digiuno cronico.

Dose-risposta: durata del digiuno ed entità dell'autofagia

Emerge una relazione dose-risposta in cui durate di digiuno più lunghe mostrano una più chiara attivazione dell'autofagia. Il digiuno completo di 4 giorni (Pietrocola et al.) e la dieta mima-digiuno di 5 giorni (Espinoza et al.) hanno dimostrato incrementi misurabili del flusso [1, 2]. Il digiuno di 72 ore (Vendelbo, Bak) ha mostrato l'attivazione della via autofagica attraverso la soppressione di mTOR e la sovraregolazione di ULK1 [5, 6], anche se il flusso è rimasto ambiguo. Gli studi sui digiuni notturni di 12-15 ore hanno mostrato risultati variabili: Chen et al. hanno riscontrato un'attivazione nei soggetti sani [11], ma Singh et al. non hanno rilevato variazioni del flusso se misurato post-realimentazione [3, 4], e Van Dyck et al. hanno ritenuto un digiuno di 12 ore insufficiente per alterare i marcatori autofagici ematici [9].

L'alimentazione a tempo limitato (time-restricted eating) giornaliera (finestre di 6-8 ore) ha mostrato effetti modesti dopo più giorni. Jamshed et al. hanno riscontrato un aumento del 22% nell'espressione di LC3A dopo 4 giorni con finestre alimentari di 6 ore [7], mentre Karahan et al. hanno rilevato un incremento di ATG-5 dopo 8 settimane di alimentazione a tempo limitato 16:8 [8]. L'esposizione cumulativa in questi studi (28 ore di digiuno totale in 4 giorni per Jamshed; 672 ore in 8 settimane per Karahan) suggerisce che cicli giornalieri ripetuti di digiuno possano produrre pattern autofagici differenti rispetto a singoli digiuni prolungati.

Modulazione del contesto metabolico

Lo stato metabolico durante il digiuno modula le risposte autofagiche. Gli studi che riportano un aumento dei chetoni (β-idrossibutirrato) hanno mostrato una concomitante attivazione dell'autofagia: Jamshed et al. hanno riscontrato un aumento dei chetoni mattutini con sovraregolazione di LC3A [7], Van Dyck et al. hanno evidenziato un incremento di β-idrossibutirrato a partire da 4 ore di digiuno con risposta metabolica al digiuno [9], ed Espinoza et al. hanno riscontrato un aumento dei chetoni insieme a un potenziamento del flusso autofagico nel gruppo sottoposto a dieta mima-digiuno [1]. I chetoni possono fungere da biomarcatore del viraggio metabolico necessario per l'attivazione dell'autofagia.

Schwalm et al. 2015 hanno dimostrato che l'intensità dell'esercizio fisico attiva l'autofagia attraverso vie AMPK-dipendenti indipendentemente dal digiuno [12]. L'esercizio ad alta intensità ha aumentato la fosforilazione di AMPKα e il flusso autofagico indipendentemente dallo stato nutrizionale (a digiuno vs alimentato) [12], suggerendo che l'attivazione di AMPK—sia attraverso la deplezione energetica durante l'esercizio sia mediante la deprivazione di nutrienti durante il digiuno—rappresenti un meccanismo comune. Questa convergenza meccanicistica spiega perché l'esercizio fisico e il digiuno possano attivare l'autofagia attraverso vie di segnalazione condivise nonostante i diversi stimoli scatenanti.

Stato patologico e capacità autofagica basale

Il riscontro di Chen et al. secondo cui i pazienti affetti da malattia renale cronica non sono riusciti ad attivare l'autofagia durante il digiuno notturno, a fronte di una robusta attivazione nei controlli sani [11], dimostra che la patologia può abolire l'autofagia indotta dal digiuno. Analogamente, Van Dyck et al. hanno studiato pazienti critici in terapia intensiva che hanno mostrato variazioni minime dei marcatori di autofagia nonostante la risposta metabolica al digiuno [9]. Ciò suggerisce che la malattia grave comprometta la capacità cellulare di induzione dell'autofagia, potenzialmente tramite infiammazione, stress ossidativo o disfunzione metabolica. Bak et al. hanno rilevato che i soggetti obesi presentavano una minore espressione di proteine correlate all'autofagia nel tessuto adiposo nonostante una lipolisi totale più elevata [6], indicando che l'obesità può attenuare le risposte autofagiche a livello tissutale anche quando il metabolismo sistemico risponde al digiuno.

Considerazioni sulla qualità degli studi

I disegni crossover randomizzati in cui i partecipanti fungono da controllo di se stessi (Jamshed, Schwalm 2015 e 2017, Vendelbo, Bak) riducono al minimo la variabilità interindividuale e forniscono evidenze più solide rispetto agli studi a braccio singolo pre-post (Singh 2024 e 2025, Tkhakushinov) o ai disegni caso-controllo (Chen) [3–7, 11–14]. Tuttavia, anche gli studi crossover ben progettati che utilizzano marcatori statici affrontano limitazioni interpretative rispetto agli studi che misurano il flusso mediante inibitori lisosomiali. Lo studio randomizzato di Espinoza et al., nonostante le ridotte dimensioni del campione e la sponsorizzazione industriale (sebbene i finanziatori non abbiano partecipato alla conduzione o all'analisi) [1], fornisce dati di flusso di elevata qualità ottenuti mediante una metodologia convalidata.

Integrazione e implicazioni cliniche

Sintetizzando questi fattori, le evidenze suggeriscono che il digiuno prolungato (≥72 ore) o le diete mima-digiuno attivino l'autofagia nei tessuti metabolicamente attivi, in particolare nel muscolo scheletrico, con incrementi misurabili del flusso se valutati con metodi appropriati. Questa attivazione richiede una durata sufficiente a indurre viraggi metabolici, tra cui la chetogenesi e una sostanziale soppressione di mTOR. Periodi di digiuno giornaliero più brevi (12-15 ore) mostrano effetti incoerenti sull'autofagia, probabilmente a causa della tempistica di misurazione rispetto alla realimentazione, del tessuto esaminato e della variabilità individuale nella flessibilità metabolica. Le cellule ematiche, in particolare i linfociti, appaiono meno responsive all'autofagia indotta dal digiuno rispetto al muscolo o a specifiche popolazioni monocitarie. Gli stati patologici, tra cui la malattia renale cronica e le patologie critiche, possono abolire o attenuare sostanzialmente le risposte autofagiche al digiuno.

Gli studi sull'uomo che misurano l'autofagia con saggi di flusso convalidati rimangono scarsi, limitando le conclusioni definitive sui protocolli di digiuno ottimali per l'induzione dell'autofagia. La discordanza tra i modelli preclinici che mostrano una robusta attivazione dell'autofagia e gli studi sull'uomo che evidenziano variazioni modeste o assenti suggerisce differenze interspecie nella regolazione dell'autofagia o mette in luce i limiti delle attuali tecniche di misurazione sull'uomo. La ricerca futura richiede protocolli standardizzati di misurazione del flusso, valutazioni tessuto-specifiche e un'attenta considerazione della tempistica di misurazione rispetto ai cicli di digiuno e realimentazione.