BCS-luokan IV paradoksin voittaminen senolyyteissä: Hydrofobisten flavonoidien nanomikellaarinen annostelu kohdennettuun solusenesenssin puhdistamiseen
Tiivistelmä
Toimitetun kirjallisuuden perusteella fisetiini ja kversetiini esiintyvät toistuvasti bioaktiivisina flavonoideina, joiden todellista suorituskykyä rajoittaa formulaatiosta riippuva altistus; useat lähteet kuvaavat nimenomaan tavanomaisten valmisteiden tai liuosten/suspensioiden huonoa vesiliukoisuutta ja alhaista mitattavissa olevaa hyötyosuutta.[1–4] Useat nano- ja lipidipohjaiset lähestymistavat (liposomit, nanoliposomit, polymeeriset misellit, nanosuspensiot, nanoemulsiot, nanokokleaatit, SNEDDS) esitetään käytännön strategioina systeemisen altistuksen ja/tai imeytymiskinetiikan parantamiseksi, usein saavuttaen suuria kvantitatiivisia lisäyksiä AUC-arvossa tai suhteellisessa hyötyosuudessa.[3–9] Aineiston vahvin ihmisen farmakokineettinen signaali on hybridi miselli-hydrogeelissä -fisetiinijärjestelmä (FF-20), joka kasvatti fisetiinin AUC0–12h-arvoa 26,9-kertaiseksi ja Cmax-arvoa 9,97 ng/mL:stä 238,2 ng/mL:ään verrattuna formulaatioimattomaan vertailuvalmisteeseen, pidentäen samalla aikaikkunaa, jonka aikana fisetiini oli kvantifioitavissa plasmasta.[4]
Senolyyttinen perustelu
Tässä aineistossa fisetiini on määritelty eksplisiittisesti senoterapeuttiseksi tai senolyyttiseksi flavonoidiksi useissa lähteissä, mukaan lukien tutkimus, jossa fisetiini valittiin erityisesti ”hyvin tutkituksi senoterapeuttiseksi lääkeaineeksi” liposomitestausta varten, sekä katsauslausunto, jonka mukaan fisetiinillä on ”senolyyttisiä vaikutuksia”.[10, 11] Toimitetuissa otteissa viitattu prekliininen in vivo -näyttö toteaa, että kymmenen in vivo testatun luonnollisen flavonoidin joukossa fisetiini raportoitiin ”voimakkaimmaksi senolyyttiseksi yhdisteeksi”, joka vähensi senesenssimarkkereita progeroideilla ja vanhoilla hiirillä.[12] Kuitenkin ainoa aineistoon sisältyvä suora senesenssimallikoe (doksorubisiinin indusoima senesenssi A549- ja WI38-soluissa) ei havainnut selektiivistä senolyysiä vapaalla fisetiinillä tai fisetiiniä sisältävillä liposomeilla elinkykyisyysmäärityksissä, vaikka SASP-sytokiinien IL-6 ja IL-8 senomorfista modulaatiota havaittiin edelleen ELISA-menetelmällä.[10]
Liposomaaliset kapselointistrategiat
Liposomaalista fisetiiniä edustavat useat valmistus- ja karakterisointitavat, mukaan lukien ohutkalvomenetelmä, jossa käytetään määriteltyjä fosfolipidejä ja kolesterolia, sekä ohutkalvohaihdutukseen perustuva nanoliposomialusta, jossa on valinnainen hyaluronihappopinnoite stabiilisuuden ja ruoansulatusvaiheen misellisoitumistulosten parantamiseksi.[10, 13] Eräässä in vitro -senesenssitutkimuksessa liposomit valmistettiin sekoittamalla DOPC, DSPE ja kolesteroli orgaaniseen liuottimeen, muodostamalla lipidikalvo, rehydratoimalla se HEPES-puskuriin ja ekstrudoimalla polykarbonaattikalvojen läpi 100 nm kokoon yhtenäisten lipisomien saamiseksi.[10] Tyhjien lipisomien Z-average oli 115,9 ± 0.9 nm (PDI 0,155 ± 0,004) ja ζ-potentiaali −20,3 ± 0,6 mV, kun taas fisetiinin kapselointi pienensi koon 95,1 ± 1,0 nm:iin (PDI 0,178 ± 0,008) ja siirsi ζ-potentiaalin arvoon −11,6 ± 1,2 mV kapselointitehokkuuden ollessa 13,68 %.[10]
Erillisessä nanoliposomijärjestelmässä käytettiin lesitiiniä ja fisetiiniä massa-suhteessa 25:1 fisetiinipitoisuuden ollessa 0,8 mg/mL. Se valmistettiin ohutkalvohaihdutuksella ja ultraäänikäsittelyllä (2 min teholla 40 W/cm²), mikä tuotti ~80 nm suorakulmaisia nanoliposomeja, joiden PDI oli noin 0,3.[13] Hyaluronihappopinnoite (HA) valmistettiin liuottamalla HA fosfaattipuskuriin ja sekoittamalla se nanoliposomien kanssa tilavuussuhteessa 1:10 yön yli kestäneessä sekoituksessa. HA:n molekyylipaino vaikutti kapselointitehokkuuteen (90–95 % arvoilla 3/35/90–100 kDa, laskien 79 %:iin tasolla 150–250 kDa ja 74 %:iin tasolla 1000–1500 kDa).[13]
Polymeeriset ja itseorganisoituvat misellit
Polymeeriset misellit kuvataan aineistossa nanomittakaavan ydin-kuori-rakenteina, jotka muodostuvat amfifiilisistä blokkikopolymeereistä, ja useat kversetiinimisellijärjestelmät tarjoavat kvantitatiivisia parannuksia oraaliseen PK-profiiliin.[2, 5, 7] Rotilla MPEG-b-PLLA-kversetiinimisellin (valmistettu ohutkalvohydraatiolla) partikkelikoko oli 88,5 ± 2,6 nm, PDI 0,13 ± 0,04, kapselointitehokkuus 82,5 ± 2,1 % ja zetapotentiaali −8,72 ± 1,03 mV.[7] Tämä miselli kasvatti AUC0–∞-arvoa tasosta 4633,71 ± 557,67 h·ng/mL (vesisuspensio) tasoon 41677,10 ± 4573,95 h·ng/mL, ja sen raportoitiin olevan 9-kertainen lisäys suhteellisessa oraalisessa hyötyosuudessa korkeammalla Cmax-arvolla (1920,83 ± 250,14 ng/mL vs 628,67 ± 64,66 ng/mL) ja viivästyneellä Tmax-arvolla (7,3 ± 1,6 h vs 3,0 ± 1,1 h).[7]
Toisessa kversetiinimisellä-lähestymistavassa käytettiin Soluplus-misellejä, jotka valmistettiin modifioidulla kalvodispersiolla (Soluplus plus F127). Tässä 7 % teoreettinen lääkeainekuorma tuotti partikkelikoon 79,00 ± 2,24 nm, PDI:n 0,154 ± 0,044, kapselointitehokkuuden 95,91 % ± 4,05 % ja zetapotentiaalin −17,10 ± 2,30 mV.[2] Beagle-koirilla nämä misellit pidensivät kversetiinin havaittavuutta 24 tunnista (vapaa lääkeaine) 48 tuntiin (miselli) ja kasvattivat Cmax-arvoa tasosta 5,24 μg·mL−1 tasoon 7,56 μg·mL−1, raportoidun puoliintumisajan ollessa 2,19 kertaa pidempi kuin puhtaalla kversetiinillä.[2]
Kiinteät lipidi- ja nanopartikkelialustat
Misellien ja lipisomien lisäksi aineisto sisältää useita nanopartikkelialustoja, kuten polymeeriset nanopartikkelit (PLGA), proteiininanopartikkelit (BSA-pohjaiset), kitosaani-ionigeelausnanopartikkelit sekä nanosuspensiot/nanokiteet, joista jokaisella on yksityiskohtaiset koko- ja kapselointimittarit.[1, 14–16] Fisetiinin PLGA-nanopartikkelit kehitettiin suonensisäistä arviointia varten; esimerkkiformulaation (NP4) keskimääräinen partikkelikoko oli ~330 nm, ζ-potentiaali −7,2 mV, PDI 0,25, kapselointitehokkuus 83,58 % ja lääkeainekuorma 13,93 %.[17] Toinen fisetiinin PLGA-nanopartikkelijärjestelmä (FST-NP) raportoi keskimääräiseksi kooksi 187,9 nm, PDI:ksi 0,121, ζ-potentiaaliksi −29,2 mV ja kapselointitehokkuudeksi 79,3 %. Se tuotti 4,9-, 3,2- ja 2,3-kertaisen läpäisevyyden verrattuna suspensioon käänteisessä suolipussimallissa pohjukaissuolen, tyhjäsuolen ja sykkyräsuolen alueilla.[15]
Folaatti-kohdennetut fisetiininanopartikkelit (FFANPs) raportoitiin monodisperseinä pallomaisina partikkeleina (150 nm, PDI 0,117), joilla oli korkea kapselointitehokkuus (92,36 % ± 3,84) ja kuormituskapasiteetti 8,39 % ± 3,04, tukien reseptori-kohdennettua paradigmaa oraalisen altistusparadigman sijaan toimitetussa otteessa.[14] Kitosaani/TPP-ionigeelaus-fisetiininanopartikkelien (FNPs) keskimääräinen koko oli 363,1 ± 17,2 nm ja ζ-potentiaali +17,7 ± 0,1 mV, kapselointitehokkuuden ollessa 78,79 ± 7,7 % ja kuormituskapasiteetin 37,46 ± 6,6 %.[1]
Itseemulgoituvat ja nanoemulsiojärjestelmät
Aineisto kuvaa sekä SNEDDS-konsepteja määritelmätasolla että konkreettisia nanoemulsiojärjestelmiä, joilla on in vivo PK-tuloksia fisetiinille, korostaen formulaatiolähtöistä imeytymiskinetiikkaa ja annostehokkuutta sairausmalleissa.[5, 6] Fisetiinille optimoitu nanoemulsioformulaatio (nanoemulsio 9) koostui Miglyol 812 N (10 %), Labrasol (10 %), Tween 80 (2,5 %), Lipoid E80 (1,2 %), glyserolista (2,25 %), NaOH (0.1N) pH-arvoon 7 ja vedestä 100 %:iin asti. Miglyolia sisältävän valmisteen nanopartikkelihalkaisijaksi ilmoitettiin 146 ± 3 nm ja erittäin alhaiseksi PDI-arvoksi 0,015.[6] Saman nanoemulsioperheen pisarahalkaisijaksi ilmoitettiin myös 153 ± 2 nm, negatiiviseksi ζ-potentiaaliksi −28,4 ± 0,6 mV ja PDI-arvoksi 0,129. Nanoemulsio raportoitiin stabiiliksi 4 °C:ssa 30 päivän ajan, faasierottumisen tapahtuessa 20 °C:ssa.[6]
Farmakokineettisesti tämän fisetiininanoemulsion suonensisäisen annon (13 mg/kg) raportoitiin osoittavan ei-merkitsevää eroa systeemisessä altistuksessa verrattuna vapaaseen fisetiiniin, kun taas intraperitoneaalinen anto tuotti 24-kertaisen lisäyksen suhteellisessa hyötyosuudessa verrattuna vapaaseen fisetiiniin, mikä johtui nopeammasta imeytymisestä, kuten lyhyempi keskimääräinen imeytymisaika (MAT 1,97 h vs 5,98 h) osoitti.[6]
Kversetiinille eräs SNEDDS-tutkimus kuvasi optimoidun nanoemulgoituvan formulaation, jossa käytettiin triasetiinia öljyfaasina, Tween 20 -surfaktanttia ja etanolia kosurfaktanttina. NE4-partikkelikoko oli 11,96 nm ja raportoitu lääkeainepitoisuus korkea (~97,98 % – 100,88 %).[18]
Kvantitatiiviset hyötyosuuden parannukset
Tässä poimittu kirjallisuus tukee johdonmukaista mallia: nano-/lipidipohjaiset annostelujärjestelmät voivat muuttaa altistusta moninkertaisesti verrattuna tavanomaisiin liuoksiin, suspensioihin tai formulaatioimattomiin vertailuvalmisteisiin. Moninkertaiset parannukset on raportoitu suoraan useissa riippumattomissa tutkimuksissa ja katsauksissa.[3–5, 7–9] Alla oleva taulukko kokoaa raportoidut moninkertaiset hyödyt ja keskeiset PK-päätepisteet täsmälleen lähteiden mukaisesti käyttäen AUC-pohjaista suhteellista hyötyosuutta, jos se on saatavilla.
Ensikierto- ja imeytymisrajoitteet
Vaikka aineisto ei suoraan kvantifioi maksan metaboliareittejä, useat tutkimukset osoittavat toiminnallisesti, että formulaatio voi ohjata imeytymisprosessia ja aikataulua, mukaan lukien nopeampi imeytyminen (lyhyempi MAT) intraperitoneaalisesti annostellulla fisetiininanoemulsiolla ja pidennetty havaittavuus ihmisen FF-20-valmisteella verrattuna formulaatioimattomaan vertailuvalmisteeseen.[4, 6] Kversetiinille useat oraaliset nanokantajat pidentävät systeemistä viipymää, mukaan lukien kaseiininanopartikkelit, jotka säilyttivät mitattavat plasmapitoisuudet jopa 72 tuntiin asti (vs 24 h ei-syklodekstriini-nanopartikkelilla), ja Soluplus-misellit, jotka pidensivät havaitsemisen 48 tuntiin verrattuna vapaan lääkeaineen 24 tuntiin koirilla.[2, 3] Tiedot osoittavat myös, että nanokantajat voivat siirtää Tmax-arvoa kumpaankin suuntaan järjestelmän rakenteesta riippuen, kuten viivästynyt Tmax MPEG-b-PLLA-kversetiinimiselleissä (7,3 h vs 3,0 h) ja lyhentynyt Tmax kversetiinin Pickering-emulsiossa (1,75 h vs 3,33 h).[7, 19]
Analyyttinen validointi
Aineisto tarjoaa laajaa näyttöä siitä, että flavonoidien nanoformulaatioiden kvantitatiivinen arviointi tukeutuu voimakkaasti nestekromatografiaan (HPLC/UPLC) ja LC-MS/MS-menetelmiin, hyödyntäen lisäksi UV-Vis-absorbanssia ja fluoresenssimenetelmiä formulaation karakterisointiin ja pitoisuusmäärityksiin.[1, 4, 7, 9, 10, 13] FF-20:n ihmisen fisetiinifarmakokinetiikassa fisetiini ja sen metaboliitti geraldoli kvantifioitiin käyttämällä UPLC-ESI-MS/MS (QTRAP) -menetelmää negatiivisen ionin MRM-tilassa asetonitriiliuuton ja suodatuksen jälkeen; fisetiinipitoisuus mitattiin myös validoidulla HPLC-analyysillä.[4] Rotan kversetiinimisellien farmakokinetiikassa kolmoiskvadrupooli-LC-MS/MS-menetelmä kvantifioi kversetiinin MRM-transitiolla m/z 301,1 → 151,0 kromatografisella erotuksella Agilent Eclipse-C18 -kolonnilla isokraattisella vesi/metanoli-mobiilifaasilla.[7]
Useissa formulaatioartikkeleissa käytettiin HPLC-UV- tai HPLC-DAD-menetelmiä pitoisuus- ja vapautumis-/läpäisykokeissa, mukaan lukien fisetiininanoemulsion kvantifiointi käänteisfaasisen HPLC:n avulla UV-detektiolla 360 nm:ssä ja kversetiinillä ladattujen kaseiininanopartikkelien kvantifiointi HPLC-UV-menetelmällä DAD-detektiolla 370 nm:ssä.[3, 6] Joissakin järjestelmissä käytettiin UV-Vis-spektrofotometriaa fisetiini- tai kversetiinipitoisuuden arvioimiseen (esim. fisetiini 364 nm:ssä kitosaaninanopartikkeleille; kversetiini 374 nm:ssä SNEDDS-liukenemis/lääkeainepitoisuudelle), ja eräässä liposomaalisessa fisetiinitutkimuksessa fisetiinipitoisuus kvantifioitiin spektrofluorometrialla heräte/emissio-aallonpituuksilla 418/486 nm.[1, 10, 18]
Senesenssi- ja tehokkuustulokset
Suorat senesenssimallien tulokset aineistossa rajoittuvat tällä hetkellä yhteen in vitro -tutkimukseen, jossa testattiin fisetiiniä ja fisetiinillä ladattuja liposomeja doksorubisiinin indusoimissa senesenssimalleissa. Tutkimuksessa vapaa fisetiini tai fisetiinillä ladatut liposomit eivät tuottaneet senesenttien solujen selektiivistä apoptoosia suhteessa ei-senesentteihin soluihin elinkykyisyysmäärityksissä.[10] Sama tutkimus raportoi kuitenkin senomorfista aktiivisuutta, josta osoituksena oli vähentynyt IL-6- ja IL-8-eritys senesenteissä soluissa, ja määritteli sekä vapaan että liposomaalisen fisetiinin moduloivan SASP:ta ELISA-analyysin perusteella.[10] Näitä löydöksiä täydentäen otteisiin sisältyvä ulkoinen in vivo -senolyyttiväite toteaa, että fisetiini raportoitiin voimakkaimmaksi senolyytiksi kymmenen in vivo testatun flavonoidin joukossa, vähentäen senesenssimarkkereita progeroideilla ja vanhoilla hiirillä, mutta ilman formulaatiotietoja kyseisessä lainauksessa.[12]
Senesenssipäätepisteiden ulkopuolella useat nanoformulaatiot osoittavat sairausmalleissa tehokkuutta, joka on linjassa altistuksen paranemisen kanssa. Esimerkiksi fisetiininanoemulsio saavutti 53 % kasvaimen tilavuuden pienenemisen annoksella 36,6 mg/kg verrattuna ~6 kertaa korkeampaan vapaan fisetiinin annokseen (223 mg/kg) samanlaisen kasvaimen kasvun eston saavuttamiseksi Lewis-keuhkokarsinoomaa kantavilla hiirillä.[6] Muita ei-senesenssitehokkuusesimerkkejä ovat fisetiininanosuspensio, joka paransi muistia ja oppimista sekä vähensi MAO-A-tasoja Aβ(25–35)-indusoiduissa dementiahierissä, sekä fisetiini-kitosaaninanopartikkelit, jotka vähensivät tulehdussytokiinien lähetti-RNA:ta (TNF-α ja IL-6) ja lisäsivät IL-10:tä IL-1β-esikäsitellyissä kondrosyyteissä estäen samalla rustoon liittyvien transkriptien (Sox-9 ja COL2) vähenemistä.[1, 16]
Translatiivinen tila
Aineisto sisältää useita vapaaehtoisilla ihmisillä tehtyjä hyötyosuustutkimuksia sekä fisetiini- että kversetiini-formulaatioille, mikä antaa suoraa translatiivista merkitystä altistuksen parantamisväitteille.[4, 8] Fisetiinille tehtiin satunnaistettu, kaksoissokkoutettu cross-over-tutkimus 15 terveellä vapaaehtoisella, jossa verrattiin 1000 mg UF-annosta 1000 mg FF-20-annokseen (sisältää 192 mg fisetiiniä) 10 päivän pesujaksolla. Tämä mahdollisti suoran koehenkilön sisäisen PK-vertailun, joka osoitti merkittävästi korkeamman AUC- ja Cmax-arvon FF-20:lle sekä pidemmän kvantifioitavissa olevan keston fisetiinille plasmassa.[4] Kversetiinille tehtiin avoin cross-over-tutkimus 12 terveellä aikuisella vapaaehtoisella, jossa arvioitiin kolmea kversetinituotetta. Tulosten mukaan LipoMicel-nestemisellimatriisi saavutti 8-kertaisen AUC- ja 9-kertaisen Cmax-lisäyksen verrattuna vapaaseen kversetiiniin, Cmax-arvon ollessa 182,85 ng/mL ajassa Tmax 0,5 h.[8]
Puutteet ja tulevaisuuden suunnat
Toimitetun näytön puitteissa keskeinen puute on oraalisen hyötyosuuden parannusten rajallinen kytkentä suoriin senesenssin puhdistamisen päätepisteisiin (esim. senesenttien solujen selektiivinen eliminointi), koska ainoa tässä esitetty eksplisiittinen senesenssimallikoe osoitti senomorfista SASP-vähenemistä ilman senolyyttistä selektiivisyyttä sekä vapaalle fisetiinille että fisetiinillä ladatuille liposomeille.[10] Toinen puute on se, että jotkut alustat raportoivat merkittäviä parannuksia biopäästävyydessä tai läpäisevyydessä (esim. fisetiininanoliposomit kasvattivat biopäästävyyden 88,9–92,5 %:iin verrattuna 7,2 %:iin massaöljyssä, ja PLGA-fisetiininanopartikkelit kasvattivat suolen läpäisevyyttä jopa 4,9-kertaiseksi käänteisessä suolipussimallissa) ilman rinnakkaista in vivo systeemistä PK-vahvistusta toimitetuissa otteissa.[13, 15]
Näytön perusteella pääteltävissä oleva käytännön tulevaisuuden suunta on formulaation karakterisoinnin tiukempi integrointi validoituihin bioanalyyttisiin mittauksiin. Koska aineisto osoittaa laajan metodologisen kirjon – kliinisestä PK-tutkimuksesta (LC-MS/MS ja UHPLC-HRMS) formulaation seulonnan UV-Vis-määrityksiin (kapselointi tai liukeneminen) – harmonisoidut kvantifiointistrategiat voisivat parantaa tutkimusten välistä vertailukelpoisuutta.[1, 4, 8, 18] Toinen tulevaisuuden suunta on formulaation valinta räätälöitynä haluttujen imeytymisprofiilien mukaan, sillä tutkimukset osoittavat sekä viivästyneitä että nopeutuneita Tmax-arvoja kantajatyypistä riippuen (esim. MPEG-b-PLLA-misellit viivästyttävät Tmax:ia vs Pickering-emulsiot lyhentävät sitä), mikä viittaa siihen, että ”paras” formulaatio voi vaihdella terapeuttisen tavoitteen ja annosteluikkunan mukaan.[7, 19]
