BCS Class IV -paradoksin voittaminen senolyyteissä: hydrofobisten flavonoidien nanomikellipohjainen annostelu kohdennettuun solusenesenssin eliminointiin
Yhteenveto
Toimitetussa kirjallisuudessa fisetin ja quercetin esiintyvät toistuvasti bioaktiivisina flavonoidina, joiden todellista suorituskykyä rajoittaa formulaatiosta johtuva vähäinen altistus. Useat lähteet kuvaavat nimenomaan tavanomaisten valmisteiden tai liuosten/suspensioiden heikkoa vesiliukoisuutta ja matalaa mitattavissa olevaa biologista hyötyosuutta.[1–4] Useat nano- ja lipidipohjaiset lähestymistavat (liposomit, nanoliposomit, polymeeriset mikellit, nanosuspensiot, nanoemulsiot, nanokokleaatit, SNEDDS) esitetään käytännön strategioina systeemisen altistuksen ja/tai imeytymiskinetiikan parantamiseksi, usein huomattavilla kvantitatiivisilla lisäyksillä AUC-arvossa tai suhteellisessa biologisessa hyötyosuudessa.[3–9] Aineiston vahvin kliininen farmakokineettinen signaali on hybridi micelle-in-hydrogel fisetin -systeemi (FF-20), joka kasvatti fisetin AUC0–12h -arvoa 26.9-kertaiseksi ja Cmax-arvoa 9.97 ng/mL:sta 238.2 ng/mL:aan verrattuna formulaatioimattomaan vertailuvalmisteeseen, samalla pidentäen aikaikkunaa, jonka kuluessa fisetin oli kvantifioitavissa plasmasta.[4]
Senolyyttinen perustelu
Tässä aineistossa fisetin määritellään useissa lähteissä eksplisiittisesti senoterapeuttiseksi tai senolyyttiseksi flavonoidiksi, mukaan lukien tutkimus, jossa fisetin valittiin nimenomaan "hyvin tutkittuna senoterapeuttisena lääkeaineena" liposomitesteihin, sekä katsauslausunto, jonka mukaan fisetin-yhdisteellä on "senolyyttisiä vaikutuksia".[10, 11] Viitatuissa prekliinisissä in vivo -todisteissa todetaan, että kymmenen in vivo testatun luonnollisen flavonoidin joukossa fisetin raportoitiin olevan "tehokkain senolyyttinen yhdiste", joka vähensi senesenssimarkkereita progeroidisilla ja vanhoilla hiirillä.[12] Kuitenkin aineiston ainoa suora senesenssimallikoe (doxorubicin-indusoitu senesenssi A549- ja WI38-soluissa) ei osoittanut selektiivistä senolyysiä vapaalle fisetin-yhdisteelle tai fisetin-ladatuille liposomeille elinkykyisyysmäärityksissä, vaikka SASP-sytokiinien IL-6 ja IL-8 senomorfista modulaatiota havaittiinkin ELISA-analyysillä.[10]
Liposomikapselointistrategiat
Liposomaalista fisetin-valmistetta edustavat useat valmistus- ja karakterisointitavat, mukaan lukien ohutkalvomenetelmä (thin-layer / thin-film), jossa käytetään määriteltyjä fosfolipidejä ja cholesterol-yhdistettä, sekä ohutkalvohaihdutukseen perustuva nanoliposomialusta, jossa on valinnainen hyaluronic-acid-päällyste stabiiliuden ja digestiovaiheen mikellisoitumisen parantamiseksi.[10, 13] Eräässä in vitro -senesenssitutkimuksessa liposomit valmistettiin sekoittamalla DOPC, DSPE ja cholesterol orgaaniseen liuottimeen, muodostamalla lipidikalvo, rehydratoimalla HEPES-puskuriin ja ekstrudoimalla polykarbonaattikalvojen läpi 100 nm kokoon yhtenäisten liposomien saamiseksi.[10] Näiden tyhjien liposomien Z-average oli 115.9 ± 0.9 nm (PDI 0.155 ± 0.004) ja ζ-potential −20.3 ± 0.6 mV, kun taas fisetin-kapselointi pienensi koon 95.1 ± 1.0 nm:iin (PDI 0.178 ± 0.008) ja siirsi ζ-potential-arvon −11.6 ± 1.2 mV:iin, kapselointitehokkuuden ollessa 13.68%.[10]
Erillisessä nanoliposomisysteemissä käytettiin lecithin- ja fisetin-yhdisteitä massasuhteessa 25:1, fisetin-pitoisuuden ollessa 0.8 mg/mL. Se valmistettiin ohutkalvohaihdutuksella ja ultraäänikäsittelyllä (2 min teholla 40 W/cm²), mikä tuotti noin 80 nm suorakulmaisia nanoliposomeja, joiden PDI oli noin 0.3.[13] Hyaluronic acid (HA) -päällyste valmistettiin liuottamalla HA fosfaattipuskuriin ja sekoittamalla se nanoliposomien kanssa tilavuussuhteessa 1:10 yön yli sekoittaen. HA-molekyylipaino vaikutti kapselointitehokkuuteen (90–95 % tasolla 3/35/90–100 kDa, laskien 79 %:iin tasolla 150–250 kDa ja 74 %:iin tasolla 1000–1500 kDa).[13]
Polymeeriset ja itsestään rakentuvat mikellit
Polymeeriset mikellit kuvataan aineistossa nanomittakaavan ydin/kuori-rakenteina, jotka muodostuvat amfifiilisistä lohkokopolymeereistä. Useat quercetin-mikellisysteemit tarjoavat kvantitatiivisia parannuksia oraaliseen PK-profiiliin.[2, 5, 7] Rotilla MPEG-b-PLLA quercetin -mikellin (valmistettu ohutkalvorehydraatiolla) partikkelikoko oli 88.5 ± 2.6 nm, PDI 0.13 ± 0.04, kapselointitehokkuus 82.5 ± 2.1 % ja zeta-potentiaali −8.72 ± 1.03 mV.[7] Tämä mikelli kasvatti AUC0–∞ -arvon 4633.71 ± 557.67 h·ng/mL:sta (vesisuspensio) 41677.10 ± 4573.95 h·ng/mL:aan, ja sen raportoitiin nimenomaisesti merkitsevän 9-kertaista lisäystä suhteellisessa oraalisessa biologisessa hyötyosuudessa, korkeammalla Cmax-arvolla (1920.83 ± 250.14 ng/mL vs 628.67 ± 64.66 ng/mL) ja viivästyneellä Tmax-arvolla (7.3 ± 1.6 h vs 3.0 ± 1.1 h).[7]
Toisessa quercetin-mikellilähestymistavassa käytettiin Soluplus-mikellejä, jotka valmistettiin modifioidulla kalvodispergiolla (Soluplus ja F127). Tässä 7 % teoreettinen lääkeainekuorma tuotti partikkelikoon 79.00 ± 2.24 nm, PDI-arvon 0.154 ± 0.044, kapselointitehokkuuden 95.91 % ± 4.05 % ja zeta-potentiaalin −17.10 ± 2.30 mV.[2] Beagle-koirilla nämä mikellit pidensivät quercetin-yhdisteen havaittavuutta 24 tunnista (vapaa lääkeaine) 48 tuntiin (mikelli) ja kasvattivat Cmax-arvon 5.24 μg·mL−1:stä 7.56 μg·mL−1:een, samalla kun puoliintumisajan raportoitiin olevan 2.19 kertaa pidempi kuin puhtaalla quercetin-yhdisteellä.[2]
Kiinteät lipidi- ja nanopartikkelialustat
Mikellien ja liposomien lisäksi aineisto sisältää useita nanopartikkelialustoja, kuten polymeeriset nanopartikkelit (PLGA), proteiininanopartikkelit (BSA-pohjaiset), kitosaanin ionigeelautumiseen perustuvat nanopartikkelit sekä nanosuspensiot/nanokristallit, joista jokaisesta on yksityiskohtaiset koko- ja kapselointimetriikat.[1, 14–16] PLGA-nanopartikkelit fisetin-yhdisteelle kehitettiin laskimonsisäistä arviointia varten; esimerkkiformulaation (NP4) keskimääräinen partikkelikoko oli ~330 nm, ζ-potential −7.2 mV, PDI 0.25, kapselointitehokkuus 83.58 % ja lääkeainekuorma 13.93 %.[17] Toinen PLGA-nanopartikkelisysteemi fisetin-yhdisteelle (FST-NP) raportoi keskimääräiseksi kooksi 187.9 nm, PDI-arvoksi 0.121, ζ-potential-arvoksi −29.2 mV ja kapselointitehokkuudeksi 79.3 %. Se tuotti 4.9, 3.2 ja 2.3 kertaa korkeamman permeaation kuin suspensio käännetyssä suolistopussimallissa pohjukaissuolen, tyhjänsuolen ja sykkyräsuolen osalta.[15]
Folaattiin kohdennetut fisetin-nanopartikkelit (FFANP:t) raportoitiin monodispersseinä pallomaisina 150 nm partikkeleina, joiden PDI oli 0.117, kapselointitehokkuus korkea (92.36 % ± 3.84) ja kuormituskapasiteetti 8.39 % ± 3.04, mikä tukee reseptoriin kohdentamisen paradigmaa oraalisen altistusparadigman sijasta toimitetussa otteessa.[14] Kitosaani/TPP-ionigeelautumisella valmistettujen fisetin-nanopartikkelien (FNP:iden) keskimääräinen koko oli 363.1 ± 17.2 nm ja ζ-potential +17.7 ± 0.1 mV, kapselointitehokkuuden ollessa 78.79 ± 7.7 % ja kuormituskapasiteetin 37.46 ± 6.6 %.[1]
Itse-emulgoituvat ja nanoemulsiosysteemit
Aineisto kuvaa sekä SNEDDS-konsepteja määritelmätasolla että konkreettisia nanoemulsiosysteemejä, joilla on in vivo PK-tuloksia fisetin-yhdisteelle, korostaen formulaatiolähtöistä imeytymiskinetiikkaa ja annostehokkuutta sairausmalleissa.[5, 6] Fisetin-yhdisteelle optimoitu nanoemulsioformulaatio (nanoemulsio 9) koostui Miglyol 812 N (10 %), Labrasol (10 %), Tween 80 (2.5 %), Lipoid E80 (1.2 %), glyserolista (2.25 %), NaOH (0.1N) pH 7:ään ja vedestä 100 %:iin. Miglyol-pitoisen valmisteen nanopartikkelien halkaisijaksi ilmoitettiin 146 ± 3 nm ja PDI-arvoksi erittäin matala 0.015.[6] Saman nanoemulsioperheen pisarahalkaisijaksi ilmoitettiin 153 ± 2 nm, negatiiviseksi ζ-potential-arvoksi −28.4 ± 0.6 mV ja PDI-arvoksi 0.129. Nanoemulsion raportoitiin olevan stabiili 4 °C:ssa 30 päivää, mutta faasiseparaatiota tapahtui 20 °C:ssa.[6]
Farmakokineettisesti tämän fisetin-nanoemulsion laskimonsisäisen annostelun (13 mg/kg) ei raportoitu osoittavan merkittävää eroa systeemisessä altistuksessa verrattuna vapaaseen fisetin-yhdisteeseen, kun taas vatsakalvonsisäinen annostelu tuotti 24-kertaisen lisäyksen suhteellisessa biologisessa hyötyosuudessa verrattuna vapaaseen fisetin-yhdisteeseen. Tämä johtui nopeammasta imeytymisestä, mikä heijastui lyhyempänä keskimääräisenä imeytymisaikana (MAT 1.97 h vs 5.98 h).[6]
Quercetin-yhdisteen osalta eräs SNEDDS-tutkimus kuvasi optimoidun nanoemulgoituvan formulaation, jossa käytettiin triacetin-öljyfaasia, Tween 20 -surfaktanttia ja etanolia ko-surfaktanttina. NE4-partikkelikoko oli 11.96 nm ja raportoitu lääkeainepitoisuus oli korkea (~97.98 % – 100.88 %).[18]
Kvantitatiiviset biologisen hyötyosuuden lisäykset
Tässä poimitussa kirjallisuudessa toistuu yhdenmukainen kaava: nano/lipid-annostelujärjestelmät voivat muuttaa altistusta moninkertaisesti verrattuna tavanomaisiin liuoksiin, suspensioihin tai formulaatiomattomiin vertailuvalmisteisiin. Muutoskertoimet on raportoitu suoraan useissa riippumattomissa tutkimuksissa ja katsauksissa.[3–5, 7–9] Alla oleva taulukko kokoaa raportoidut moninkertaiset lisäykset ja keskeiset PK-päätepisteet tarkalleen lähteiden mukaisesti, käyttäen AUC-pohjaista suhteellista biologista hyötyosuutta siellä missä se on saatavilla.
Ensimmäisen kierron metabolia ja imeytymisrajoitteet
Vaikka aineisto ei suoraan kvantifioi maksan metaboliatietä, useat tutkimukset osoittavat toiminnallisesti, että formulaatio voi hallita imeytymisprosessia ja aikataulua. Tähän kuuluu nopeampi imeytyminen (lyhyempi MAT) vatsakalvonsisäisesti annostellulla fisetin-nanoemulsiolla ja pidennetty havaittavuus ihmisillä FF-20-valmisteella verrattuna formulaatioimattomaan vertailuvalmisteeseen.[4, 6] Quercetin-yhdisteen osalta useat oraaliset nanokantajat pidentävät viipymää systeemisessä kierrossa, mukaan lukien kaseiininanopartikkelit, jotka säilyttivät mitattavat pitoisuudet plasmassa 72 tuntiin asti (vs 24 h ei-syklodekstriini-nanopartikkelitilanteessa), ja Soluplus-mikellit, jotka pidensivät havaintoajan 48 tuntiin verrattuna vapaan lääkeaineen 24 tuntiin koirilla.[2, 3] Tiedot osoittavat myös, että nanokantajat voivat siirtää Tmax-arvoa kumpaankin suuntaan järjestelmän rakenteesta riippuen, kuten viivästynyt Tmax MPEG-b-PLLA quercetin -mikelleissä (7.3 h vs 3.0 h) ja lyhentynyt Tmax quercetin Pickering -emulsiossa (1.75 h vs 3.33 h).[7, 19]
Analyyttinen validointi
Aineisto antaa kattavaa näyttöä siitä, että flavonoidien nanoformulaatioiden kvantitatiivinen arviointi nojaa vahvasti nestekromatografiaan (HPLC/UPLC) ja LC-MS/MS-menetelmiin, joiden lisäksi käytetään UV-Vis-absorbanssia ja fluoresenssimenetelmiä formulaation karakterisointiin ja pitoisuusmäärityksiin.[1, 4, 7, 9, 10, 13] FF-20-valmisteen ihmisillä tehdyissä fisetin-farmakokinetiikkatutkimuksissa fisetin ja sen metaboliitti geraldol kvantifioitiin käyttämällä UPLC-ESI-MS/MS (QTRAP) -laitteistoa negatiivisessa ioni-MRM-tilassa asetonitriiliuuton ja suodatuksen jälkeen; fisetin-pitoisuus mitattiin myös validoidulla HPLC-analyysillä.[4] Rottien quercetin-mikellien farmakokinetiikassa kolmoiskvadrupooli-LC-MS/MS-menetelmä kvantifioi quercetin-pitoisuuden MRM-siirtymällä m/z 301.1 → 151.0, kromatografisen erotuksen tapahtuessa Agilent Eclipse-C18 -kolonnilla isokraattisella vesi/metanoli-mobiilifaasilla.[7]
Useissa formulaatiopapereissa käytettiin HPLC-UV- tai HPLC-DAD-menetelmiä pitoisuus- ja vapautumis/permeaatiomäärityksissä, mukaan lukien fisetin-nanoemulsion kvantifiointi käänteisfaasitransformaatio-HPLC:llä UV-detektiolla aallonpituudella 360 nm ja quercetin-ladattujen kaseiininanopartikkelien kvantifiointi HPLC-UV-menetelmällä DAD-detektorilla aallonpituudella 370 nm.[3, 6] Jotkin järjestelmät käyttivät UV-Vis-spektrofotometriaa fisetin- tai quercetin-pitoisuuden arviointiin (esim. fisetin aallonpituudella 364 nm kitosaaninanopartikkeleille; quercetin aallonpituudella 374 nm SNEDDS-liukoisuus/lääkeainepitoisuusmäärityksissä), ja eräässä liposomaalisen fisetin-tutkimuksessa fisetin-pitoisuus kvantifioitiin spektrofluorometrialla viritys/emissio-aallonpituuksilla 418/486 nm.[1, 10, 18]
Senesenssi ja tehotulokset
Suorat senesenssimallitulokset aineistossa painottuvat tällä hetkellä yhteen in vitro -tutkimukseen, jossa testattiin fisetin-yhdistettä ja fisetin-ladattuja liposomeja doxorubicin-indusoiduissa senesenssimalleissa. Tutkimuksessa vapaa fisetin tai fisetin-ladatut liposomit eivät tuottaneet selektiivistä apoptoosia senesenssisoluissa verrattuna ei-senesenssisoluihin elinkykyisyysmäärityksissä.[10] Sama tutkimus raportoi kuitenkin senomorfisesta aktiivisuudesta, josta osoituksena oli vähentynyt IL-6- ja IL-8-eritys senesenssisoluissa, ja määritteli sekä vapaan että liposomaalisen fisetin-yhdisteen moduloivan SASP-tekijöitä ELISA-analyysin perusteella.[10] Näitä löydöksiä täydentää otteissa oleva ulkoinen in vivo -senolyyttiväite, jonka mukaan fisetin raportoitiin olevan tehokkain senolyytti kymmenen in vivo testatun flavonoidin joukossa, vähentäen senesenssimarkkereita progeroidisilla ja vanhoilla hiirillä, mutta ilman formulaatiotietoja kyseisessä lainauksessa.[12]
Senesenssipäätepisteiden ulkopuolella useat nanoformulaatiot osoittavat sairausmalleissa tehoa, joka on linjassa parantuneen altistuksen kanssa. Esimerkiksi fisetin-nanoemulsio saavutti 53 % kasvaimen volyymin pienenemisen annoksella 36.6 mg/kg, kun taas vastaavaan kasvun estoon tarvittiin noin 6 kertaa suurempi vapaan fisetin-yhdisteen annos (223 mg/kg) Lewis lung carcinoma -hiirimallissa.[6] Muita esimerkkejä ei-senesenssitehosta ovat fisetin-nanosuspensio, joka paransi muistia ja oppimista sekä vähensi MAO-A-tasoja Aβ(25–35)-indusoiduissa dementiastatuksen hiirissä, sekä fisetin-kitosaaninanopartikkelit, jotka vähensivät tulehdussytokiinien lähetti-RNA:ta (TNF-α ja IL-6) ja lisäsivät IL-10-tasoja IL-1β-esikäsitellyissä kondrosyyteissä, samalla estäen rustoon liittyvien transkriptien (Sox-9 ja COL2) vähenemistä.[1, 16]
Translationaalinen tila
Aineisto sisältää useita ihmisvapaaehtoisilla tehtyjä biologisen hyötyosuuden tutkimuksia sekä fisetin- että quercetin-formulaatioille, mikä antaa suoraa translationaalista merkitystä altistuksen parantamisväitteille.[4, 8] Fisetin-yhdisteen osalta satunnaistettu, kaksoissokkoutettu, vaihtovuoroinen tutkimus 15 terveellä vapaaehtoisella vertasi 1000 mg annosta UF-valmistetta 1000 mg annokseen FF-20-valmistetta (joka sisälsi 192 mg fisetin-yhdistettä) 10 päivän washout-jaksolla. Tämä mahdollisti suoran koehenkilön sisäisen PK-vertailun, joka osoitti huomattavasti korkeamman AUC- ja Cmax-arvon FF-20-valmisteelle sekä pidemmän keston, jolloin fisetin oli kvantifioitavissa plasmasta.[4] Quercetin-yhdisteen osalta ei-sokkoutettu vaihtovuoroinen tutkimus 12 terveellä aikuisella vapaaehtoisella arvioi kolmea quercetin-tuotetta ja raportoi, että LipoMicel-nestemikellimatriisi saavutti 8-kertaisen AUC- ja 9-kertaisen Cmax-lisäyksen verrattuna vapaaseen quercetin-yhdisteeseen, Cmax-arvon ollessa 182.85 ng/mL kohdassa Tmax 0.5 h.[8]
Puutteet ja tulevaisuuden suunnat
Toimitetun näytön puitteissa keskeinen puute on oraalisen biologisen hyötyosuuden parannusten vähäinen kytkentä suoriin senesenssin eliminointipäätepisteisiin (esim. senesenssisolujen selektiivinen eliminointi), koska ainoa tässä esitetty eksplisiittinen senesenssimallikoe osoitti senomorfista SASP-vähenemistä ilman senolyyttistä selektiivisyyttä sekä vapaalle fisetin-yhdisteelle että fisetin-ladatuille liposomeille.[10] Toinen puute on se, että jotkin alustat raportoivat huomattavia parannuksia bioaccessibiliteetissa tai permeaatiossa (esim. fisetin-nanoliposomit lisäsivät bioaccessibiliteetin 88.9–92.5 %:iin verrattuna bulkkiöljyn 7.2 %:iin, ja PLGA fisetin -nanopartikkelit lisäsivät suoliston permeaatiota jopa 4.9-kertaiseksi käännetyssä suolistopussimallissa) ilman rinnakkaista in vivo systeemistä PK-varmistusta tässä toimitetuissa otteissa.[13, 15]
Näytön osoittama käytännön tulevaisuuden suunta on formulaation karakterisoinnin tiiviimpi integrointi validoituihin bioanalyyttisiin mittauksiin, sillä aineisto osoittaa laajan metodologisen kirjon — kliinisen PK-tutkimuksen LC-MS/MS- ja UHPLC-HRMS-menetelmistä formulaatioseulonnan UV-Vis-määrityksiin kapseloinnille tai liukenemiselle — mikä viittaa siihen, että harmonisoidut kvantifiointistrategiat voisivat parantaa tutkimusten välistä vertailukelpoisuutta.[1, 4, 8, 18] Toinen tulevaisuuden suunta on haluttuihin imeytymisprofiileihin räätälöity formulaatiovalinta, koska tutkimukset osoittavat sekä viivästyneitä että nopeutuneita Tmax-arvoja kantajatyypistä riippuen (esim. MPEG-b-PLLA-mikellit viivästyttävät Tmax-arvoa vs Pickering-emulsiot lyhentävät sitä), mikä viittaa siihen, että "paras" formulaatio voi vaihdella terapeuttisen tavoitteen ja annosteluikkunan mukaan.[7, 19]
