Przełamywanie paradoksu klasy IV BCS w senolitykach: Nanomicelarny transport hydrofobowych flawonoidów w celu celowanego usuwania starzejących się komórek
Podsumowanie wykonawcze
W dostępnej literaturze fisetin i quercetin wielokrotnie pojawiają się jako bioaktywne flawonoidy, których wydajność w rzeczywistych warunkach jest ograniczona przez ekspozycję determinowaną przez formulację, przy czym wiele źródeł wyraźnie opisuje słabą rozpuszczalność w wodzie i niską mierzalną biodostępność dla konwencjonalnych preparatów lub roztworów/zawiesin.[1–4] Liczne podejścia oparte na nanotechnologii i lipidach (liposomes, nanoliposomes, polymeric micelles, nanosuspensions, nanoemulsions, nanocochleates, SNEDDS) są przedstawiane jako praktyczne strategie poprawy ekspozycji ogólnoustrojowej i/lub kinetyki wchłaniania, często z dużymi ilościowymi przyrostami AUC lub relatywnej biodostępności.[3–9] Najsilniejszy sygnał farmakokinetyczny u ludzi w zbiorze danych pochodzi z hybrydowego układu fisetin typu micela-w-hydrożelu (FF-20), który zwiększył AUC0–12h dla fisetin 26.9-krotnie i Cmax z 9.97 ng/mL do 238.2 ng/mL w porównaniu z nieformułowanym komparatorem, jednocześnie wydłużając okno czasowe, w którym fisetin był mierzalny w osoczu.[4]
Racjonalne uzasadnienie senolityczne
W ramach tego zbioru danych fisetin jest jednoznacznie określany jako flawonoid senoterapeutyczny lub senolityczny w wielu źródłach, w tym w badaniu, w którym wybrano fisetin konkretnie jako „dobrze przebadany lek senoterapeutyczny” do testów w liposomach, oraz w oświadczeniu przeglądowym, że fisetin wykazuje „efekty senolityczne”.[10, 11] Dowody przedkliniczne in vivo przytoczone w dostarczonych fragmentach wskazują, że spośród dziesięciu naturalnych flawonoidów badanych in vivo, fisetin został uznany za „najsilniejszy związek senolityczny”, redukujący markery starzenia u myszy progeroidalnych i starych.[12] Jednak jedyny uwzględniony w zbiorze danych eksperyment na bezpośrednim modelu starzenia się (starzenie indukowane doksorubicyną w komórkach A549 i WI38) nie wykazał selektywnej senolizy dla wolnego związku fisetin ani liposomalnego fisetin w testach żywotności, przy jednoczesnym zaobserwowaniu senomorficznej modulacji cytokin SASP IL-6 i IL-8 w teście ELISA.[10]
Strategie enkapsulacji liposomalnej
Liposomalny fisetin jest reprezentowany przez wiele podejść do otrzymywania i charakteryzowania, w tym metodę cienkiej warstwy / cienkiego filmu z użyciem zdefiniowanych fosfolipidów i cholesterol, a także platformę nanoliposomów otrzymywanych metodą odparowania cienkiego filmu z opcjonalną powłoką z kwasu hialuronowego w celu zapewnienia stabilności i uzyskania micelaryzacji w fazie trawienia.[10, 13] W jednym badaniu starzenia in vitro liposomy przygotowano przez zmieszanie DOPC, DSPE i cholesterol w rozpuszczalniku organicznym, tworząc film lipidowy, nawadniając go w buforze HEPES i ekstrudując przez membrany poliwęglanowe do wielkości 100 nm w celu uzyskania jednorodnych liposomów.[10] Liposomy te wykazywały średnią Z-average 115.9 ± 0.9 nm (PDI 0.155 ± 0.004) i potencjał ζ −20.3 ± 0.6 mV w postaci pustej, podczas gdy enkapsulacja fisetin zmniejszyła rozmiar do 95.1 ± 1.0 nm (PDI 0.178 ± 0.008) i przesunęła potencjał ζ do −11.6 ± 1.2 mV, przy wydajności enkapsulacji wynoszącej 13.68%.[10]
Osobny system nanoliposomów wykorzystywał lecithin i fisetin w stosunku masowym 25:1 przy stężeniu fisetin 0.8 mg/mL, wytworzony metodą odparowania cienkiego filmu i ultrasonikacji (2 min przy 40 W/cm²), co dało prostokątne nanoliposomy o wielkości ~80 nm z PDI około 0.3.[13] Powłokę z kwasu hialuronowego (HA) przygotowano przez rozpuszczenie HA w buforze fosforanowym i zmieszanie z nanoliposomami w stosunku objętościowym 1:10 przy całonocnym mieszaniu, a masa cząsteczkowa HA wpływała na wydajność enkapsulacji (90–95% przy 3/35/90–100 kDa, spadając do 79% przy 150–250 kDa i 74% przy 1000–1500 kDa).[13]
Micele polimerowe i samoasocjujące
Micele polimerowe są wyraźnie opisane w zbiorze danych jako nanoskalowe zespoły rdzeń/powłoka tworzone przez amfifilowe kopolimery blokowe, a wiele systemów micelarnych quercetin zapewnia ilościową poprawę PK po podaniu doustnym.[2, 5, 7] U szczurów micela quercetin oparta na MPEG-b-PLLA (przygotowana przez nawadnianie cienkiego filmu) wykazała wielkość cząstek 88.5 ± 2.6 nm z PDI 0.13 ± 0.04, wydajność enkapsulacji 82.5 ± 2.1% i potencjał zeta −8.72 ± 1.03 mV.[7] Micela ta zwiększyła AUC0–∞ z 4633.71 ± 557.67 h·ng/mL (zawiesina wodna) do 41677.10 ± 4573.95 h·ng/mL, co zostało odnotowane jako 9-krotny wzrost relatywnej biodostępności doustnej, przy wyższym Cmax (1920.83 ± 250.14 ng/mL vs 628.67 ± 64.66 ng/mL) i opóźnionym Tmax (7.3 ± 1.6 h vs 3.0 ± 1.1 h).[7]
Drugie podejście do micel quercetin wykorzystywało micele Soluplus przygotowane metodą zmodyfikowanej dyspersji filmu (Soluplus plus F127), w której teoretyczne obciążenie lekiem wynoszące 7% pozwoliło uzyskać wielkość cząstek 79.00 ± 2.24 nm z PDI 0.154 ± 0.044, wydajność enkapsulacji 95.91% ± 4.05% i potencjał zeta −17.10 ± 2.30 mV.[2] U psów rasy beagle micele te wydłużyły wykrywalność quercetin z 24 h (wolny lek) do 48 h (micela) i zwiększyły Cmax z 5.24 μg·mL−1 do 7.56 μg·mL−1, wykazując okres półtrwania 2.19-krotnie dłuższy niż czysty quercetin.[2]
Platformy lipidów stałych i nanocząstek
Poza micelami i liposomami, zbiór danych obejmuje wiele platform nanocząsteczkowych, obejmujących nanocząstki polimerowe (PLGA), nanocząstki białkowe (oparte na BSA), nanocząstki otrzymywane metodą żelowania jonowego chitosan oraz nanosuspensions/nanocrystals, każda ze szczegółowymi parametrami wielkości i enkapsulacji.[1, 14–16] Nanocząstki PLGA dla fisetin zostały opracowane pod kątem oceny dożylnej, przy czym przykładowa formuła (NP4) wykazała średnią wielkość cząstek ~330 nm, potencjał ζ −7.2 mV, PDI 0.25, wydajność enkapsulacji 83.58% i obciążenie lekiem 13.93%.[17] Drugi system nanocząstek PLGA dla fisetin (FST-NP) wykazał średnią wielkość 187.9 nm, PDI 0.121, potencjał ζ −29.2 mV i wydajność enkapsulacji 79.3%, generując 4.9×, 3.2× i 2.3× wyższą przenikalność niż zawiesina w modelu odwróconego worka jelitowego odpowiednio w dwunastnicy, jelicie czczym i jelicie krętym.[15]
Nanocząstki fisetin celowane w receptory folanowe (FFANPs) zostały opisane jako monodyspersyjne kuliste cząstki o wielkości 150 nm z PDI 0.117 i wysoką wydajnością enkapsulacji (92.36% ± 3.84) przy zdolności ładunkowej 8.39% ± 3.04, wspierając paradygmat celowania w receptory, a nie paradygmat ekspozycji doustnej w dostarczonym fragmencie.[14] Nanocząstki fisetin otrzymywane metodą żelowania jonowego chitosan/TPP (FNPs) miały średnią wielkość 363.1 ± 17.2 nm i potencjał ζ +17.7 ± 0.1 mV, przy wydajności enkapsulacji 78.79 ± 7.7% i zdolności ładunkowej 37.46 ± 6.6%.[1]
Systemy samoemulgujące i nanoemulsyjne
Zbiór danych opisuje zarówno koncepcje SNEDDS na poziomie definicji, jak i konkretne systemy nanoemulsyjne z wynikami PK in vivo dla fisetin, kładąc nacisk na kinetykę wchłaniania sterowaną formułą i wydajność dawki w modelach chorobowych.[5, 6] W przypadku fisetin, zoptymalizowana formuła nanoemulsji (nanoemulsja 9) składała się z Miglyol 812 N (10%), Labrasol (10%), Tween 80 (2.5%), Lipoid E80 (1.2%), glycerol (2.25%), NaOH (0.1N) do pH 7 oraz wody do 100%, przy czym dla preparatu zawierającego Miglyol odnotowano średnicę nanocząstek 146 ± 3 nm i bardzo niskie PDI 0.015.[6] Ta sama rodzina nanoemulsji została również scharakteryzowana jako posiadająca średnicę kropel 153 ± 2 nm, ujemny potencjał ζ −28.4 ± 0.6 mV oraz PDI 0.129; nanoemulsja była stabilna w 4 °C przez 30 dni, wykazując separację faz w 20 °C.[6]
Pod względem farmakokinetycznym, podanie dożylne tej nanoemulsji fisetin w dawce 13 mg/kg nie wykazało znaczącej różnicy w ekspozycji ogólnoustrojowej w porównaniu do wolnego fisetin, podczas gdy podanie otrzewnowe spowodowało 24-krotny wzrost relatywnej biodostępności w porównaniu do wolnego fisetin, co przypisano szybszemu wchłanianiu, odzwierciedlonemu przez krótszy średni czas wchłaniania (MAT 1.97 h vs 5.98 h).[6]
W przypadku quercetin, jedno badanie SNEDDS opisało zoptymalizowaną formułę samoemulgującą wykorzystującą triacetin jako fazę olejową, Tween 20 jako surfaktant i ethanol jako ko-surfaktant, z wielkością cząstek NE4 wynoszącą 11.96 nm i zgłoszoną wysoką zawartością leku (~97.98% do 100.88%).[18]
Ilościowe przyrosty biodostępności
Literatura cytowana w niniejszym opracowaniu potwierdza spójny schemat: systemy dostarczania nano/lipidowe mogą wielokrotnie zwiększać ekspozycję w porównaniu do konwencjonalnych roztworów, zawiesin lub nieformułowanych komparatorów, przy czym krotności zmian są raportowane bezpośrednio w wielu niezależnych badaniach i przeglądach.[3–5, 7–9] Poniższa tabela konsoliduje raportowane przyrosty i kluczowe punkty końcowe PK dokładnie tak, jak podano w źródłach, wykorzystując relatywną biodostępność opartą na AUC tam, gdzie była dostępna.
Ograniczenia pierwszego przejścia i absorpcji
Chociaż zbiór danych nie określa ilościowo ścieżek metabolizmu wątrobowego, kilka badań operacyjnie wykazuje, że formulacja może kontrolować proces i przebieg czasowy absorpcji, w tym szybsze wchłanianie (krótszy MAT) dla nanoemulsji fisetin podawanej otrzewnowo oraz wydłużoną wykrywalność dla ludzkiego preparatu FF-20 w porównaniu z nieformułowanym komparatorem.[4, 6] W przypadku quercetin, liczne nanonośniki doustne wydłużają czas przebywania w układzie ogólnoustrojowym, w tym nanocząstki kazeinowe, które utrzymywały mierzalne poziomy w osoczu do 72 h (w porównaniu do 24 h dla nanocząstek bez cyklodekstryny) oraz micele Soluplus, które wydłużyły wykrywalność do 48 h w porównaniu do 24 h dla wolnego leku u psów.[2, 3] Dane pokazują również, że nanonośniki mogą przesuwać Tmax w dowolnym kierunku, zależnie od architektury systemu, np. opóźnione Tmax w micelach MPEG-b-PLLA quercetin (7.3 h vs 3.0 h) i skrócone Tmax w emulsji Pickeringa z quercetin (1.75 h vs 3.33 h).[7, 19]
Walidacja analityczna
Zbiór danych dostarcza obszernych dowodów na to, że ilościowa ocena nanoformuł flawonoidów opiera się głównie na chromatografii cieczowej (HPLC/UPLC) i LC-MS/MS, z dodatkowym wykorzystaniem metod absorbancji UV-Vis i fluorescencji do charakteryzowania formulacji i oznaczania zawartości.[1, 4, 7, 9, 10, 13] W badaniach farmakokinetyki fisetin u ludzi dla FF-20, fisetin i jego metabolit geraldol zostały oznaczone ilościowo za pomocą UPLC-ESI-MS/MS (QTRAP) w trybie ujemnej jonizacji MRM po ekstrakcji acetonitrylem i filtracji, a zawartość fisetin mierzono również za pomocą walidowanej analizy HPLC.[4] W badaniach farmakokinetyki micel quercetin u szczurów, metoda LC-MS/MS z potrójnym kwadrupolem pozwoliła na oznaczenie ilościowe quercetin poprzez przejście MRM m/z 301.1 → 151.0 z rozdziałem chromatograficznym na kolumnie Agilent Eclipse-C18 w izokratycznej fazie ruchomej woda/metanol.[7]
W kilku pracach dotyczących formulacji wykorzystano HPLC-UV lub HPLC-DAD do testów zawartości i uwalniania/przenikania, w tym oznaczenie ilościowe nanoemulsji fisetin metodą HPLC w układzie faz odwróconych z detekcją UV przy 360 nm oraz oznaczenie ilościowe nanocząstek kazeinowych obciążonych quercetin metodą HPLC-UV z DAD przy 370 nm.[3, 6] Niektóre systemy wykorzystywały spektrofotometrię UV-Vis do szacowania stężenia fisetin lub quercetin (np. fisetin przy 364 nm dla nanocząstek chitosan; quercetin przy 374 nm dla rozpuszczania/zawartości leku w SNEDDS), a w jednym badaniu liposomalnego fisetin stężenie fisetin oznaczono metodą spektrofluorometrii przy wzbudzeniu/emisji 418/486 nm.[1, 10, 18]
Wyniki w zakresie starzenia się i skuteczności
Bezpośrednie wyniki w modelach starzenia się w zbiorze danych są obecnie zdominowane przez jedno badanie in vitro testujące fisetin i liposomalny fisetin w modelach starzenia indukowanego doksorubicyną, w którym ani wolny fisetin, ani liposomalny fisetin nie spowodowały selektywnej apoptozy komórek starzejących się w porównaniu do komórek niestarzejących się w testach żywotności.[10] To samo badanie wykazało niemniej aktywność senomorficzną potwierdzoną zmniejszonym wydzielaniem IL-6 i IL-8 w starzejących się komórkach i określiło zarówno wolny, jak i liposomalny fisetin jako czynniki modulujące SASP w analizie ELISA.[10] Uzupełnieniem tych ustaleń jest zewnętrzna deklaracja dotycząca działania senolitycznego in vivo zawarta we fragmentach, która stwierdza, że fisetin został uznany za najsilniejszy środek senolityczny spośród dziesięciu flawonoidów testowanych in vivo, redukujący markery starzenia u myszy progeroidalnych i starych, aczkolwiek w dostarczonym cytacie brak szczegółów dotyczących formulacji.[12]
Poza punktami końcowymi dotyczącymi starzenia, liczne nanoformuły wykazują skuteczność w modelach chorobowych zgodną z poprawą ekspozycji, w tym nanoemulsja fisetin osiągająca 53% redukcję objętości guza przy dawce 36.6 mg/kg w porównaniu do ~6-krotnie wyższej dawki wolnego fisetin (223 mg/kg) dla podobnego zahamowania wzrostu guza u myszy z rakiem płuc Lewisa.[6] Inne przykłady skuteczności niezwiązanej ze starzeniem obejmują nanosuspensję fisetin poprawiającą pamięć i uczenie się oraz redukującą poziom MAO-A u myszy z demencją indukowaną Aβ(25–35), a także nanocząstki fisetin z chitosan redukujące mRNA cytokin zapalnych (TNF-α i IL-6) i zwiększające IL-10 w chondrocytach poddanych wstępnemu działaniu IL-1β, przy jednoczesnym zapobieganiu redukcji transkryptów związanych z chrząstką (Sox-9 i COL2).[1, 16]
Status translacyjny
Zbiór danych obejmuje wiele badań biodostępności na ludzkich ochotnikach dla formuł zarówno fisetin, jak i quercetin, zapewniając bezpośrednie znaczenie translacyjne dla deklaracji dotyczących zwiększenia ekspozycji.[4, 8] W przypadku fisetin, zrandomizowane, badanie z podwójnie ślepą próbą w układzie naprzemiennym u 15 zdrowych ochotników porównało dawkę 1000 mg UF z 1000 mg FF-20 (dostarczającą 192 mg fisetin) z 10-dniowym okresem wypłukiwania, umożliwiając bezpośrednie porównanie PK wewnątrzosobnicze, które wykazało wyraźnie wyższe AUC i Cmax dla FF-20 oraz dłuższy czas mierzalności fisetin w osoczu.[4] W przypadku quercetin, badanie naprzemienne bez ślepej próby u 12 zdrowych dorosłych ochotników oceniło trzy produkty quercetin i wykazało, że płynna matryca micelarna LipoMicel osiągnęła 8-krotny wzrost AUC i 9-krotny wzrost Cmax w porównaniu z wolnym quercetin, przy Cmax wynoszącym 182.85 ng/mL przy Tmax 0.5 h.[8]
Luki i przyszłe kierunki
W granicach dostarczonych dowodów, kluczową luką jest ograniczone powiązanie poprawy biodostępności doustnej z bezpośrednimi punktami końcowymi usuwania starzejących się komórek (np. selektywną eliminacją komórek starzejących się), ponieważ jedyny wyraźny eksperyment na modelu starzenia wykazał tutaj senomorficzną redukcję SASP bez selektywności senolitycznej zarówno dla wolnego fisetin, jak i liposomalnego fisetin.[10] Kolejną luką jest fakt, że niektóre platformy zgłaszają znaczną poprawę biodostępności lub przenikania (np. nanoliposomy fisetin zwiększające biodostępność do 88.9–92.5% w porównaniu do 7.2% w oleju luzem, a nanocząstki PLGA fisetin zwiększające przenikanie jelitowe do 4.9× w modelu odwróconego worka jelitowego) bez równoległego potwierdzenia ogólnoustrojowego PK in vivo w dostarczonych tutaj fragmentach.[13, 15]
Praktycznym przyszłym kierunkiem sugerowanym przez dowody jest ściślejsza integracja charakterystyki formulacji z walidowanymi pomiarami bioanalitycznymi, ponieważ zbiór danych wykazuje szerokie spektrum metodologiczne — od LC-MS/MS i UHPLC-HRMS w klinicznych badaniach PK po testy UV-Vis dla enkapsulacji lub uwalniania w badaniach przesiewowych formulacji — co sugeruje, że zharmonizowane strategie oznaczania ilościowego mogłyby poprawić porównywalność między badaniami.[1, 4, 8, 18] Drugim przyszłym kierunkiem jest dobór formulacji dostosowany do pożądanych profili wchłaniania, ponieważ badania wykazują zarówno opóźnione, jak i przyspieszone Tmax w zależności od typu nośnika (np. micele MPEG-b-PLLA opóźniające Tmax vs emulsje Pickeringa skracające je), co sugeruje, że „najlepsza” formulacja może różnić się w zależności od celu terapeutycznego i okna dawkowania.[7, 19]
