Niedestrukcyjna spektroskopia Ramana w detekcji zanieczyszczeń surowców roślinnych oparta na technologii PAT

Zastosowanie nieniszczącej spektroskopii Ramana i technologii analityki procesowej (PAT) do profilowania śladowych zanieczyszczeń w czasie rzeczywistym w roślinnych aktywnych składnikach farmaceutycznych

Abstrakt

Kontekst

Roślinne aktywne składniki farmaceutyczne (APIs) oraz roślinne substancje lecznicze wymagają strategii jakościowych zdolnych do kontrolowania zmienności i zarządzania ryzykiem zanieczyszczeń przy użyciu podejścia opartego na „całokształcie dowodów” (totality of the evidence), które obejmuje kontrolę roślinnego surowca farmaceutycznego oraz badania chemiczne, takie jak metody spektroskopowe i/lub chromatograficzne. [1] Wytyczne regulacyjne wyraźnie oczekują badań na obecność pozostałości pestycydów i przypadkowych toksyn (np. aflatoxins), a także kontroli dotyczących materiałów obcych i substancji zafałszowujących, co motywuje do stosowania metod szybkiego przesiania, które można wdrożyć w całym łańcuchu dostaw i cyklu życia produkcji. [1]

Cel

Niniejsze badanie koncepcyjne typu proof-of-concept i synteza danych oceniają, w jaki sposób nieniszcząca spektroskopia Ramana (w tym warianty wzmocnione SERS) może zostać zintegrowana z ramami technologii analityki procesowej (PAT) w celu profilowania śladowych zanieczyszczeń w czasie rzeczywistym lub zbliżonym do rzeczywistego w roślinnych API, ze szczególnym uwzględnieniem wykonalności, wydajności analitycznej i ograniczeń wdrożeniowych popartych opublikowanymi dowodami. [2, 3]

Metody

Dokonaliśmy syntezy dowodów wykazujących:

• Wrażliwość techniki Raman na strukturę chemiczną i minimalne potrzeby w zakresie przygotowania próbek; [2, 4]
• Wzmocnienie SERS i reprezentatywne demonstracje wykrywania śladowych ilości pestycydów (w tym reżimy od ppm do sub-ppb); [5–8]
• Strategie chemometryczne do uwierzytelniania substancji zafałszowujących i prognozowania ilościowego; [9–11]
• Przykłady monitorowania procesów zgodne z PAT oraz znane bariery w translacji przemysłowej. [3]

Wyniki

W zestawionych badaniach technika Raman i chemometria pozwoliły odróżnić zafałszowane olejki eteryczne, gdy inspekcja wizualna była niewystarczająca, przy czym PCA zapewniło separację spektralną między próbkami czystymi a zafałszowanymi. [9] Ilościowe modelowanie Ramana (PLSR) pozwoliło uzyskać wysoki poziom dokładności prognozowania w zadaniach przewidywania stężenia, co potwierdza zasadność ilościowego oznaczania opartego na kalibracji w złożonych formułach. [10]

W przypadku śladowych zanieczyszczeń, badania SERS wykazały wykrywalność wybranych pestycydów na poziomie 1 ppm na powierzchni owoców, a w innych pracach zmierzono LOD w zakresie 0.001–10 ppm dla 21 pestycydów przy użyciu koloidalnych nanocząstek złota. [6, 7] Ręczne urządzenia SERS z ekstrakcją octanową QuEChERS wykryły wiele pestycydów poniżej unijnego MRL wynoszącego 10 ppb w ryżu basmati dla wybranych analitów, przy czym ekstrakcję zakończono w czasie krótszym niż 15 min, co ilustruje pragmatyczny przepływ pracy typu „najpierw przesianie”. [8]

W zastosowaniach PAT, szybkie, nieniszczące i nieinwazyjne pomiary Ramana oraz możliwość wdrożenia od laboratorium po linie produkcyjne wspierają monitorowanie inline/online. Jednak dowody podkreślają również, że większość badań nad PAT pozostaje w skali laboratoryjnej, a modele procesowe Ramana mogą charakteryzować się stosunkowo wysokimi LOD, które uniemożliwiają wykrycie celów o niskim stężeniu w warunkach monitorowania ekstrakcji. [2, 3]

Wnioski

Dowody potwierdzają wykonalność koncepcji PAT opartej na Raman/SERS w zarządzaniu ryzykiem zanieczyszczeń roślinnych API: wdrożenie przenośnych urządzeń Raman do uwierzytelniania przychodzących materiałów i przesiania pod kątem zafałszowań; wykorzystanie modułów SERS do celowanego przesiania pestycydów; oraz integracja wielowymiarowych modeli opartych na technice Raman w pętlach sterowania PAT, gdzie warunki procesu pozwalają na stabilny transfer kalibracji i odpowiednią zdolność detekcji. [3, 12]

Głównymi ograniczeniami są czułość w przypadku celów ultraśladowych w heterogenicznych matrycach roślinnych, fluorescencja i słabe sygnały Ramana oraz wymogi dotyczące walidacji i transferu modeli niezbędne do akceptacji regulacyjnej podejść opartych na ograniczonych lub wyrywkowych badaniach (skip testing). [3, 4, 13]

Słowa kluczowe

• Spektroskopia Ramana
• SERS
• Technologia analityki procesowej
• Roślinne API
• Pozostałości pestycydów
• Wykrywanie substancji zafałszowujących
• Chemometria
• Monitorowanie w czasie rzeczywistym

Wstęp

Roślinne substancje lecznicze i roślinne API podlegają regulacjom w ramach paradygmatów jakościowych kładących nacisk na spójność terapeutyczną wspieraną przez podejście oparte na „całokształcie dowodów”, obejmujące kontrolę roślinnego surowca farmaceutycznego oraz chemiczne badania kontroli jakości, w których można wykorzystać metody spektroskopowe i/lub chromatograficzne. [1] W ramach tego paradygmatu ryzyko zanieczyszczenia i zafałszowania jest wyraźnie wymienione jako problematyka jakościowa wymagająca strategii badawczych, w tym testów na obecność pozostałości pestycydów (w tym pestycydów macierzystych i głównych toksycznych metabolitów) oraz przypadkowych toksyn, takich jak aflatoxins, a także kontroli dotyczących materiałów obcych i substancji zafałszowujących. [1]

Równolegle, europejskie wytyczne dotyczące specyfikacji substancji i preparatów roślinnych definiują specyfikacje jako testy, procedury i kryteria akceptacji stosowane w celu zapewnienia jakości przy zwalnianiu serii i w okresie trwałości, oraz identyfikują grupy zanieczyszczeń, które powinny być uwzględnione w stosownych przypadkach, w tym metale ciężkie/zanieczyszczenia pierwiastkowe, pozostałości pestycydów i fumigantów, mycotoxins (aflatoxins, ochratoxin A) oraz zanieczyszczenia mikrobiologiczne. [13, 14] Wytyczne EMA wskazują również, że okresowe badania wyrywkowe (skip testing) pozostałości zanieczyszczeń mogą być dopuszczalne, gdy są uzasadnione oceną ryzyka i danymi z serii, co tworzy wyraźną zachętę regulacyjną dla narzędzi szybszego przesiania i zrozumienia procesu, które mogą uzasadnić strategie kontroli oparte na ryzyku bez kompromisów w zakresie bezpieczeństwa. [13]

Spektroskopia Ramana jest kandydatem do takich strategii, ponieważ rozproszenie Ramana dostarcza specyficznych chemicznie widm typu „odcisk palca” (fingerprint), a metody Ramana są powszechnie określane jako szybkie, nieniszczące i nieinwazyjne, z prostym przygotowaniem próbki, co stanowi cechy operacyjne zgodne z podejmowaniem decyzji w czasie rzeczywistym podczas produkcji i kontroli łańcucha dostaw. [2, 4]

Przeglądy zastosowań techniki Ramana w farmacji opisują zakres wdrożenia rozciągający się od zastosowań laboratoryjnych po doki przeładunkowe i linie produkcyjne, co sugeruje, że spektroskopię Ramana można uważać nie tylko za narzędzie identyfikacji off-line, ale także za potencjalny czujnik analityczny w procesie w kontekście PAT. [2] PAT jest wyraźnie zdefiniowana jako wykorzystanie serii narzędzi i środków do realizacji analizy w czasie rzeczywistym i sterowania ze sprzężeniem zwrotnym podczas produkcji przemysłowej w celu zapewnienia kontrolowalnego procesu produkcji i optymalnej jakości produktu, a techniki spektroskopii oscylacyjnej są opisywane jako umożliwiające szybkie wykrywanie inline i w czasie rzeczywistym wewnętrznych atrybutów jakości ziół podczas przetwarzania. [3]

Jednak profilowanie śladowych zanieczyszczeń w surowcach roślinnych jest wymagające pod względem analitycznym, a literatura wskazuje na istotne wyzwania translacyjne: większość badań PAT przeprowadzono na sprzęcie w skali laboratoryjnej, gdzie warunki eksperymentalne są łatwiejsze do kontrolowania, a modele procesowe oparte na technice Raman mogą mieć stosunkowo wysokie LOD, które nie pozwalają na wykrycie celów o niskim stężeniu w symulowanych zadaniach monitorowania ekstrakcji. [3] Ograniczenia te motywują pytanie projektowe dla roślinnych API: w jaki sposób technika Raman (i wzmocniona SERS) może zostać wdrożona w ramach PAT, aby zapewniać szybkie, nieniszczące przesianie oraz, tam gdzie to możliwe, prognozy ilościowe odporne na zmienność matrycy i procesu, pozostając jednocześnie kompatybilną z opartymi na ryzyku oczekiwaniami regulacyjnymi dotyczącymi kontroli zanieczyszczeń i walidacji metod? [2, 3, 13]

W związku z tym, adresowane tutaj pytanie badawcze brzmi: Czy opublikowane dowody dotyczące wydajności metod Raman i SERS mogą wspierać praktyczną architekturę PAT do profilowania śladowych zanieczyszczeń w czasie zbliżonym do rzeczywistego w roślinnych API, która uzupełnia lub selekcjonuje klasyczne oznaczenia potwierdzające? [3, 6, 8] Hipoteza robocza zakłada, że nieniszcząca identyfikacja oparta na technice Raman będzie najskuteczniejsza jako wielopoziomowy system PAT: (i) Raman + chemometria do szybkiego uwierzytelniania/przesiania pod kątem zafałszowań; (ii) celowane moduły SERS do wykrywania śladowych ilości pestycydów w odpowiednich matrycach; oraz (iii) procesowe monitorowanie Raman dla wewnętrznych atrybutów jakości, gdzie czułość jest wystarczająca, z uzasadnionym wyrywkowym badaniem opartym na ryzyku na podstawie danych i historii serii, a nie tylko na samym wdrożeniu czujnika. [3, 6, 9, 13]

Prognozowanie ilościowe i wnioskowanie oparte na kalibracji

W zakresie prognozowania ilościowego i wnioskowania opartego na kalibracji, badanie Ramana preparatów methyl eugenol zafałszowanych xylene wykazało, że PCA było użyteczne do różnicowania zestawów danych widmowych Ramana o różnych stężeniach. Dodatkowo model PLSR był w stanie wiarygodnie przewidzieć stężenie nieznanej próbki, co demonstruje, że połączenie spektroskopii Ramana i PLSR może pozwolić na uzyskanie wysokiej wydajności prognostycznej. Podkreśla to potencjalną użyteczność w opracowywaniu modeli ilościowych dla substancji zafałszowujących o znanym ryzyku w roślinnych API, gdy dostępne są materiały referencyjne [10].

Potwierdzanie tożsamości w produktach gotowych

Metoda Ramana oparta na kodach kreskowych okazała się skuteczna w potwierdzaniu tożsamości API w produktach gotowych. Technika ta polega na porównywaniu procentowego niezerowego pokrycia między oczekiwanymi kodami kreskowymi API a kodami kreskowymi gotowego produktu leczniczego, gdzie widma są transformowane w celu podkreślenia pików Ramana [11]. Wykorzystując to podejście, 18 zatwierdzonych gotowych produktów leczniczych i dziewięć symulowanych podróbek zidentyfikowano z 100% dokładnością. Potwierdza to wykonalność stosowania opartej na technice Raman logiki „nakładania się odcisków palców” do solidnej weryfikacji tożsamości w produktach sformułowanych, pod warunkiem zastosowania odpowiednich transformacji i reguł decyzyjnych [11].

Analiza Ramana w ryzyku podobieństwa roślinnego („look-alike”)

Podejścia oparte na sygnaturach spektralnych Ramana zostały wdrożone w celu odróżnienia autentycznych próbek od zafałszowanych w kontekstach botanicznych. Na przykład analiza próbek Phansomba/Phellinus ujawniła wyraźną separację między okazami autentycznymi a zafałszowanymi. Zidentyfikowano kluczowe pasma Ramana (487, 528, 786, 892, 915 i 1436 cm) charakterystyczne dla Phellinus (szczególnie Ph. merrillii), co sugeruje potencjał budowania baz danych zakresów sygnatur dla przepływów pracy inspekcyjnej w innych lekach ziołowych [21].

Istnieją jednak ograniczenia. W przesiewowym badaniu 50 ziołowych suplementów diety z deklaracjami poprawy sprawności seksualnej, spektroskopia Ramana wykryła dziewięć zafałszowanych próbek (cztery z sildenafil i pięć z tadalafil). Nie udało się jednak uzyskać jednoznacznych wyników dotyczących zafałszowania tadalafil w dwóch próbkach, co wskazuje na potrzebę stosowania metod potwierdzających lub ulepszonych strategii interpretacji widm w niektórych przypadkach [22].

4.2 Pozostałości pestycydów metodą SERS

Opublikowane dowody podkreślają, że SERS jest szybką, nieniszczącą techniką zdolną do wykrywania pestycydów na poziomie śladowym (ppm lub ppb), zgodnie ze standardami kontroli zanieczyszczeń roślinnych [1, 6, 19]. Jedno z badań wykazało zdolność SERS do wykrywania pestycydów na powierzchniach owoców na poziomach tak niskich jak 1 ppm, co dobrze koreluje z regulacyjnymi limitami pozostałości pestycydów dla jabłek [6].

Ilościowe badania SERS wykazały wysoką wydajność kalibracji. Na przykład w jednym z badań odnotowano współczynniki determinacji (R²) wynoszące 0.99 dla omethoate i 0.98 dla chlorpyrifos, przy granicach wykrywalności (LOD) wynoszących odpowiednio 1.63 mg·cm i 2.64 mg·cm. Podkreśla to wykonalność modeli kalibracyjnych wykorzystujących charakterystyczne natężenia pików SERS do oznaczania ilościowego pozostałości [17]. W tym badaniu piki Ramana specyficzne dla analitu (413 cm dla omethoate, 346 cm dla chlorpyrifos) zostały wykorzystane do mapowania stężeń poprzez modele kalibracyjne [17].

SERS z nanocząstkami koloidalnego złota dodatkowo wzmocnił rozproszenie Ramana dla 21 różnych pestycydów. Granice wykrywalności wahały się od 0.001 do 10 ppm, przy czym jednoczesną identyfikację phosmet i thiram osiągnięto na skórce jabłka przy użyciu PCA i SERS [7].

W przypadku matryc warzyw liściastych krzywe kalibracyjne dla pozostałości pestycydów phosmet, thiabendazole i acetamiprid wykazały silne liniowe współczynniki korelacji, osiągając odzysk między 94.67% a 112.89%. Walidacje oparte na odzysku wykazały względne odchylenia standardowe między 3.87% a 8.56%. Cały proces badawczy, w tym pobieranie próbek, analizę widm i prognozowanie ilościowe, ukończono w mniej niż pięć minut, co stanowi znaczną poprawę w stosunku do tradycyjnych metod chromatograficznych [16].

W kontekście matrycy roślinnej SERS wykazał potencjał w wykrywaniu deltamethrin w Corydalis. Główny charakterystyczny pik zidentyfikowano przy 999 cm, a przyrosty w modelowaniu pozwoliły uzyskać granicę wykrywalności na poziomie 0.186 mg/L dla bezpośredniej obserwacji piku 999 cm. Zastosowanie modelu PLS również pozwoliło na uzyskanie dobrych wskaźników wydajności prognostycznej [23].

Ręczne urządzenia SERS, w połączeniu z ekstrakcją octanową QuEChERS, wykazały zdolność do wykrywania wielu pozostałości pestycydów w ryżu basmati w ciągu 15 minut. Pestycydy takie jak CBM, THI i TRI wykryto poniżej unijnego najwyższego dopuszczalnego poziomu pozostałości (MRL) wynoszącego 10 ppb. Jednak granica wykrywalności dla ACE pozostała na poziomie 800 ppb, co podkreśla potencjalną zmienność czułości analitów w wieloparametrowym przepływie pracy [8].

Dynamiczne podejścia SERS zwiększyły czułość w kontekście kropli osiadłych, umożliwiając wykrywanie paraquat, thiabendazole, tricyclazole i isocarbophos do poziomów ppm i ppb. Podejście to wykorzystuje metastabilny stan nanocząstek podczas ulatniania się w celu utrzymania zdolności rozróżniania w ekstraktach warzywnych z dodatkiem wzorca. Liniowe zależności między natężeniami charakterystycznych pików a poziomami stężenia dodatkowo walidują tę metodę [18].

4.3 Profilowanie mycotoxins i markerów mikrobiologicznych

Standardy regulacyjne nakładają obowiązek badania jakości pod kątem mycotoxins i czystości mikrobiologicznej substancji ziołowych, koncentrując się szczególnie na aflatoxins i ochratoxin A [13, 24]. Na przykład monografie USP określają maksymalny limit NMT 5 ppb dla aflatoxin B1 i NMT 20 ppb dla sumy aflatoxins B1, B2, G1 i G2 [19]. Limity te definiują czułość, którą muszą osiągnąć metody przesiewowe i potwierdzające.

Ze względu na główny nacisk na wykrywanie pestycydów techniką Raman/SERS i zastosowania w wykrywaniu zafałszowań, technologia ta najlepiej pozycjonuje się jako uzupełniające narzędzie przesiewowe w ramach szerszej strategii kontroli zanieczyszczeń. Jest to zgodne z wytycznymi regulacyjnymi sugerującymi, aby kontrola jakości była wspierana przez testy chemiczne, takie jak spektroskopia lub chromatografia, przy jednoczesnym uwzględnianiu powstających technologii [1, 13].

4.4 Wnioskowanie o metalach ciężkich i zanieczyszczeniach nieorganicznych

EMA wymaga badania na obecność metali ciężkich i innych zanieczyszczeń pierwiastkowych w ziołowych produktach leczniczych, chyba że jest to inaczej uzasadnione, co tworzy oczekiwanie regulacyjne dotyczące profilowania śladowych zanieczyszczeń w roślinnych API [13, 24].

W obecnej bazie dowodowej Raman/SERS zanieczyszczenia te są adresowane pośrednio poprzez lepszą kontrolę tożsamości surowca, szybsze przesianie pod kątem zafałszowań i priorytetyzację badań potwierdzających dla próbek wysokiego ryzyka. Jednak metody Ramana nie są obecnie pozycjonowane jako samodzielne metody ilościowego oznaczania zanieczyszczeń pierwiastkowych bez dodatkowej walidacji lub technologii uzupełniających [1, 13, 21].

4.5 In-Line i On-Line Raman PAT w przetwórstwie roślinnym

Ramy technologii analityki procesowej (PAT) wykorzystują analizę w czasie rzeczywistym do optymalizacji jakości produktu i kontroli procesu. Spektroskopia Ramana jest opisywana jako dobrze dopasowana do tego celu, oferując szybką, nieinwazyjną analizę kompatybilną z warunkami produkcji procesowej [3].

Jednym z przykładów Raman-PAT jest zastosowanie modelu RS-CARS-PLS do monitorowania procesów ekstrakcji w produkcji granulatu Wenxin. Chociaż model wykazał skuteczne monitorowanie procesu, jego czułość dla analitów o niskim stężeniu, takich jak sacharydy, była ograniczona — co podkreśla potrzebę stosowania SERS lub technik uzupełniających do wykrywania zanieczyszczeń na poziomie śladowym [3].

Wdrożenie przemysłowe stwarza dodatkowe wyzwania, ponieważ większość badań PAT odbywa się w kontrolowanych środowiskach laboratoryjnych. Solidność i kontrola zmienności muszą zostać rozwiązane w celu pomyślnego skalowania i wdrożenia na żywo [3].

4.6 Porównawcza wydajność analityczna

Konwencjonalna spektroskopia Ramana zapewnia szybkie, nieniszczące odciski palców chemicznych bez konieczności wstępnej obróbki próbek. W przeciwieństwie do niej, SERS zwiększa czułość w celu wykrywania zanieczyszczeń na poziomie śladowym, osiągając granice wykrywalności od 1 ppm do nawet 0.001 ppm dla niektórych pestycydów, w zależności od metody i matrycy [4, 5, 6, 7]. Na przykład SERS połączony z kalibracją wykazał wykrywanie pestycydów w warzywach liściastych ze współczynnikami korelacji do 0.98291 i ukończeniem całego przepływu pracy w zaledwie pięć minut [16].

W zastosowaniach uwierzytelniających technika PCA była użyteczna w różnicowaniu subtelnych różnic spektralnych w olejkach eterycznych, a techniki Ramana oparte na kodach kreskowych wykazały 100% dokładność w identyfikacji podrobionych i autentycznych produktów gotowych [9–11].

4.7 Przyrządy przenośne i ręczne do przesiania surowców

Przenośne instrumenty Ramana są pozycjonowane jako efektywne czasowo, nieniszczące narzędzia zdolne do szybkiej analizy materiałów ziołowych bez potrzeby złożonego przygotowania. Mają one również zastosowanie w monitorowaniu zgodności z przepisami BHP w produktach ziołowych, oferując cenne narzędzie zarówno do przesiania wewnątrz zakładu, jak i po wprowadzeniu na rynek [12].

Wytyczne regulacyjne FDA podkreślają nowe metody, takie jak spektroskopia Ramana kierowana morfologią (MDRS), jako użyteczne w zadaniach takich jak charakterystyka rozkładu wielkości cząstek, gdy są poparte rygorystyczną walidacją. Chociaż nie są one specyficzne dla roślinnych API, metody te demonstrują zdolność techniki Ramana do uzupełniania tradycyjnych technik analitycznych [25, 26].

Dyskusja

Zestawione dowody potwierdzają, że techniki Raman i SERS są wartościowymi narzędziami do nieniszczącego, szybkiego przesiania i monitorowania w czasie rzeczywistym w środowiskach PAT. Technologie te mogą być skutecznie integrowane z przepływami pracy w zakresie kontroli zanieczyszczeń i zapewnienia jakości roślinnych API [2, 3, 5].

5.1 Zalety techniki Ramana i PAT w porównaniu z klasycznymi metodami niszczącymi

Spektroskopia Ramana jest korzystna ze względu na swoją szybkość, właściwości nieniszczące i minimalne wymagania dotyczące przygotowania próbek. SERS rozszerza tę użyteczność, umożliwiając detekcję na poziomie śladowym poprzez mechanizmy wzmocnienia, co pozwoliło na wykrywanie pestycydów do poziomu ppb przy krótkim całkowitym czasie przepływu pracy, czyniąc tę metodę idealną do wstępnego przesiania i selekcji próbek do badań potwierdzających [2, 4, 5, 16].

5.2 Ograniczenia

Kluczowe ograniczenia obejmują wyzwania związane z czułością w podstawowych metodach Ramana, szczególnie dla analitów o niskim stężeniu bez wzmocnienia SERS. Przemysłowe wykorzystanie PAT opartego na technice Raman wymaga również pokonania wyzwań związanych ze zmiennością i solidnym skalowaniem. Ponadto pewna zależność od modeli chemometrycznych, takich jak PCA i PLS, wprowadza złożoność i potencjalną niepewność zależną od zmienności matrycy i uczenia modelu [3, 9, 22, 23].

Wytyczne regulacyjne i narzędzia przesiewowe oparte na technice Raman

Wytyczne regulacyjne wspierają podejście do jakości surowców roślinnych oparte na całokształcie dowodów, w tym kontrolę roślinnego surowca farmaceutycznego i badania kontroli jakości chemicznej przy użyciu metod spektroskopowych i/lub chromatograficznych. Zapewnia to koncepcyjną ścieżkę integracji narzędzi przesiewowych opartych na technice Raman w ogólne strategie kontroli, zamiast traktowania ich jako samodzielnych zamienników wszystkich klasycznych oznaczeń. [1]

Wytyczne FDA wyraźnie wymagają badań na obecność pozostałości pestycydów i przypadkowych toksyn, takich jak aflatoxins, a także materiałów obcych i substancji zafałszowujących. Jest to zgodne z możliwościami Raman/SERS w zakresie przesiania pestycydów i wykrywania substancji zafałszowujących, wzmacniając potrzebę pokrycia klas zanieczyszczeń w kompleksowym programie kontroli. [1]

FDA stwierdza również, że wnioskodawcy powinni oceniać obecne i powstające technologie oraz opracowywać ortogonalne metody analityczne w celu zapewnienia odpowiedniej identyfikacji i oznaczania ilościowego. Można to interpretować jako wsparcie dla wdrażania Raman/SERS jako części ortogonalnego zestawu metod sparowanego z metodami potwierdzającymi, takimi jak LC–MS lub inne oznaczenia do ostatecznego oznaczania ilościowego, szczególnie tam, gdzie wydajność SERS zależy od kontroli wstępnego przygotowania próbki dla dokładnej ilościowości względem LC–MS. [1, 27] Wspierając ten pogląd, badanie porównujące SERS i LC–MS pod kątem nieoczekiwanego herbicydu w skomplikowanej matrycy wykazało, że SERS charakteryzował się wysoką czułością i wyższą wydajnością detekcji w wykrywaniu celów ultraśladowych, podczas gdy LC–MS zapewniał dokładniejszą ilościowość ułatwioną przez dobrze kontrolowane przygotowanie wstępne próbki. Motywuje to do stosowania architektury wielopoziomowej: SERS do szybkiego, czułego wykrywania i LC–MS do potwierdzającego oznaczania ilościowego. [27]

W UE wytyczne EMA dotyczące specyfikacji definiują specyfikacje i identyfikują grupy zanieczyszczeń, które powinny zostać uwzględnione (w tym metale ciężkie, pozostałości pestycydów, mycotoxins, zanieczyszczenia mikrobiologiczne). Pozwalają one na okresowe badania wyrywkowe (skip testing), o ile są uzasadnione oceną ryzyka i danymi z serii, co sugeruje, że strumienie danych Raman/PAT mogłyby stanowić dowody wspierające dla strategii badań opartych na ryzyku, jeśli zostaną zwalidowane i wykażą zdolność do wykrywania istotnych odchyleń w odpowiednim czasie. [13, 14]

5.4 Strategia wdrożenia oparta na ryzyku i zarządzanie cyklem życia

Wytyczne USP wskazują, że zakres badań może być określony przy użyciu podejścia opartego na ryzyku, które uwzględnia prawdopodobieństwo zanieczyszczenia. Wspiera to strategię, w której intensywność przesiania Raman/SERS i badania potwierdzające są przydzielane na podstawie czynników ryzyka, takich jak źródło, geografia, historia serii i wcześniejsze dane z przesiania. [19] EMA podobnie wskazuje, że okresowe badania wyrywkowe mogą być dopuszczalne tam, gdzie jest to uzasadnione, a uzasadnienie powinno uwzględniać materiał roślinny, warunki uprawy/produkcji, zanieczyszczenia z sąsiednich gospodarstw, pochodzenie geograficzne i być poparte oceną ryzyka oraz danymi z serii, co wzmacnia potrzebę stosowania systemów monitorowania bogatych w dane zamiast doraźnych redukcji badań. [13]

W tym kontekście opartym na ryzyku, PAT oparty na technice Raman może być pozycjonowany jako generator szybkich, powtarzalnych odcisków palców i wyników przesiania, które wspierają monitorowanie trendów i szybką identyfikację nietypowych serii, podczas gdy oznaczenia potwierdzające są zarezerwowane dla serii oznaczonych flagą podczas przesiania lub do okresowej weryfikacji wydajności systemu przesiewowego i stabilności kalibracji. [2, 13] Metoda tożsamości API oparta na kodach kreskowych oraz ręczne wykrywanie zafałszowań olejków eterycznych ilustrują, jak solidne reguły decyzyjne (nakładanie się kodów kreskowych, intensywne pasma diagnostyczne) mogą uprościć decyzje przesiewowe w niektórych kontekstach, podczas gdy rozróżnianie oparte na PCA wskazuje, gdzie wymagane są modele wielowymiarowe w celu utrzymania czułości na subtelne wzorce zafałszowań. [9, 11, 20]

Zarządzanie cyklem życia metod Ramana jest również sugerowane przez obserwacje FDA dotyczące zgłoszeń MDRS: brak danych walidacyjnych dotyczących powtarzalności i dokładności jest uchybieniem, co podkreśla, że metody PAT oparte na technice Raman muszą być opracowywane z walidacją i dokumentacją wydajności jako kluczowymi elementami dla interakcji z organami regulacyjnymi. [25]

5.5 Perspektywy

Dowody sugerują wiele kierunków technicznych zwiększających wykonalność PAT opartego na technice Raman dla śladowych zanieczyszczeń. Po pierwsze, opisywana jest wykonalność zwiększonej różnorodności technik (spektroskopia Ramana z transformacją Fouriera, rezonansowa spektroskopia Ramana, konfokalna spektroskopia Ramana i SERS) w celu wzmocnienia sygnałów Ramana oraz ewolucji instrumentów i przetwarzania próbek, co wspiera strategię wyboru wariantów techniki zgodnie z potrzebami matrycy i czułości, zamiast polegania na pojedynczej konfiguracji Ramana we wszystkich procesach roślinnych. [4]

Po drugie, selektywność SERS można zwiększyć poprzez funkcjonalizację nanostruktur cząsteczkami receptorowymi, takimi jak aptamery, co wskazuje ścieżkę w kierunku celowanych oznaczeń śladowych zanieczyszczeń osadzonych w modułach PAT, gdzie interferencje stanowią dominujące ryzyko. [5]

Po trzecie, podejścia SERS oparte na obrazowaniu są opisywane jako umożliwiające monitorowanie w czasie rzeczywistym i wykrywanie lokalizacji zanieczyszczeń na powierzchniach tkanek roślinnych lub wewnątrz nich, co sugeruje, że przyszłe przepływy pracy dla roślinnych API mogłyby obejmować przestrzennie rozdzielcze mapowanie zanieczyszczeń dla materiałów wysokiego ryzyka lub do badania ścieżek zanieczyszczenia. [5] Wreszcie, praktyczny potencjał wdrożeniowy wspierają wnioski, że SERS mógłby być dalej implementowany w narzędziach do szybkiego wykrywania na miejscu dla bezpieczeństwa żywności i monitorowania środowiska, oraz dowody na to, że przenośne instrumenty Ramana mogą być używane do monitorowania zgodności ziołowych produktów leczniczych z wymogami bezpieczeństwa i higieny na rynku konsumenckim, co podkreśla ciągłość od przesiania terenowego po systemy PAT w produkcji. [12, 27]

6. Wnioski

Niniejsze badanie koncepcyjne i synteza dowodów wskazują, że spektroskopia Ramana jest dobrze dopasowana do celów PAT, ponieważ jest szybka, nieniszcząca, nieinwazyjna i prosta w przygotowaniu próbek. Zastosowania Ramana są opisywane jako obejmujące zakres od laboratorium po linie produkcyjne, wspierając spojrzenie na cykl życia pomiarów opartych na technice Raman, od przesiania przychodzącego surowca po monitorowanie wewnątrzprocesowe. [2]

PAT jest wyraźnie zdefiniowana jako umożliwiająca analizę w czasie rzeczywistym i sterowanie ze sprzężeniem zwrotnym w celu zapewnienia kontrolowalnych procesów produkcji i optymalnej jakości. Spektroskopia oscylacyjna jest opisywana jako umożliwiająca szybkie wykrywanie jakości wewnętrznej ziół online i w czasie rzeczywistym podczas przetwarzania, zapewniając koncepcyjną podstawę do umieszczania czujników Ramana w produkcji roślinnej. [3]

W przypadku śladowych zanieczyszczeń, SERS zapewnia najsilniejszą bazę dowodową dla czułości, przy czym wzmocnienie potencjalnie osiąga ultraśladowe granice wykrywalności na metalach szlachetnych, a liczne badania pestycydów wykazują reżimy detekcji od ppm do ppb, a nawet niskie nanomole, z metrykami ilościowymi i szybkimi przepływami pracy (np. 5 min całkowitego czasu testu; <15 min ekstrakcji). [5, 8, 16, 18] Chemometria jest niezbędna w wielu zadaniach związanych z autentycznością i oznaczaniem ilościowym, ponieważ inspekcja wizualna może być niewystarczająca do wykrywania zafałszowań, podczas gdy PCA i PLSR wykazały skuteczność w rozróżnianiu i prognozowaniu ilościowym. [9, 10]

Głównymi ograniczeniami dla profilowania śladowych zanieczyszczeń w czasie rzeczywistym w roślinnych API są ograniczenia czułości w niewzmocnionych modelach procesowych PAT opartych na technice Raman (ilustrowane przez stosunkowo wysokie LOD w monitorowaniu ekstrakcji) oraz wyzwania dotyczące solidności/walidacji przy skalowaniu PAT z laboratorium do produkcji, wraz z niepewnością wynikającą z matrycy w niektórych przypadkach przesiania pod kątem zafałszowań. [3, 22] W związku z tym, najbardziej uzasadnioną rekomendacją operacyjną wspieraną przez dowody jest wielopoziomowa architektura PAT:

1. Przenośny Raman + chemometria do szybkiego uwierzytelniania/przesiania pod kątem zafałszowań.
2. Celowane oznaczenia SERS dla pozostałości pestycydów wysokiego ryzyka.
3. Potwierdzające metody ortogonalne tam, gdzie ilościowość i podejmowanie decyzji regulacyjnych wymagają większej pewności, zgodnie z oczekiwaniami regulacyjnymi dotyczącymi metod ortogonalnych i opartym na ryzyku uzasadnieniem dla badań wyrywkowych. [1, 5, 12, 13, 27]

Finansowanie

Brak zewnętrznego finansowania. [1]

Konflikt interesów

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów. [1]

Oświadczenie o dostępności danych

Wszystkie dane wykorzystane w tym badaniu koncepcyjnym pochodzą z cytowanych opublikowanych źródeł i dokumentów regulacyjnych poddanych tutaj syntezie. [1, 14]

Rysunek 1

Rysunek 1. Koncepcyjny przepływ pracy PAT dla zarządzania ryzykiem zanieczyszczeń roślinnych API integrujący nieniszczącą technikę Raman i SERS: przesianie przychodzącego roślinnego surowca farmaceutycznego przy użyciu szybkiej, nieniszczącej identyfikacji Ramana w punktach przyjęć/dokach; chemometryczne kontrole uwierzytelniania/zafałszowań (np. rozróżnianie oparte na PCA; potwierdzanie tożsamości poprzez nakładanie się kodów kreskowych) w celu zapewnienia tożsamości; celowane moduły SERS do przesiania śladowych pestycydów i szybkiego prognozowania ilościowego (czułość od ppm do ppb przy krótkich czasach pomiaru); monitorowanie Raman wewnątrz procesu w operacjach jednostkowych produkcji ujęte w ramach PAT jako analiza w czasie rzeczywistym i sterowanie ze sprzężeniem zwrotnym; oraz oparte na ryzyku decyzje dotyczące okresowej weryfikacji/badań wyrywkowych wspierane historią serii i formalnymi ocenami ryzyka zgodnymi z wytycznymi EMA/USP. [2, 3, 6, 9, 11, 13, 16, 19]

Tabela 2

Tabela 3