Μη Καταστροφική Φασματοσκοπία Raman για την Ανίχνευση Προσμίξεων σε Βοτανικά Προϊόντα βάσει PAT

Εφαρμογή της Μη Καταστροφικής Φασματοσκοπίας Raman και της Αναλυτικής Τεχνολογίας Διεργασιών (PAT) για τον Προσδιορισμό Προφίλ Ιχνοστοιχείων Προσμίξεων σε Πραγματικό Χρόνο σε Φυτικά Δραστικά Φαρμακευτικά Συστατικά

Περίληψη

Υπόβαθρο

Τα φυτικά δραστικά φαρμακευτικά συστατικά (APIs) και οι φυτικές φαρμακευτικές ουσίες απαιτούν στρατηγικές ποιότητας ικανές να ελέγχουν τη μεταβλητότητα και να διαχειρίζονται τους κινδύνους μόλυνσης χρησιμοποιώντας μια προσέγγιση «συνόλου των αποδεικτικών στοιχείων» (totality of the evidence), η οποία περιλαμβάνει τον έλεγχο των φυτικών πρώτων υλών και χημικές δοκιμές, όπως φασματοσκοπικές ή/και χρωματογραφικές μεθόδους. [1] Οι κανονιστικές οδηγίες αναμένουν ρητά δοκιμές για υπολειμματικά εντομοκτόνα και τυχαίες τοξίνες (π.χ. aflatoxins), καθώς και ελέγχους που αφορούν ξένα υλικά και προσμίξεις, γεγονός που δίνει κίνητρο για προσεγγίσεις ταχείας ανίχνευσης που μπορούν να αναπτυχθούν σε όλη την αλυσίδα εφοδιασμού και τον κύκλο ζωής της παραγωγής. [1]

Στόχος

Αυτή η εννοιολογική μελέτη απόδειξης ορθότητας (proof-of-concept) και σύνθεσης δεδομένων αξιολογεί πώς η μη καταστροφική φασματοσκοπία Raman (συμπεριλαμβανομένων των παραλλαγών με ενίσχυση SERS) μπορεί να ενσωματωθεί σε ένα πλαίσιο Αναλυτικής Τεχνολογίας Διεργασιών (PAT) για τον προσδιορισμό προφίλ ιχνοστοιχείων προσμίξεων σε πραγματικό ή σχεδόν πραγματικό χρόνο σε φυτικά APIs, με έμφαση στη σκοπιμότητα, την αναλυτική απόδοση και τους περιορισμούς ανάπτυξης που υποστηρίζονται από δημοσιευμένα στοιχεία. [2, 3]

Μέθοδοι

Συνθέσαμε στοιχεία που δείχνουν:

• Την ευαισθησία της Raman στη χημική δομή και τις ελάχιστες ανάγκες προετοιμασίας δειγμάτων· [2, 4]
• Την ενίσχυση SERS και αντιπροσωπευτικές επιδείξεις ιχνοστοιχείων εντομοκτόνων (συμπεριλαμβανομένων καθεστώτων από ppm έως sub-ppb)· [5–8]
• Χημειομετρικές στρατηγικές για την επαλήθευση γνησιότητας προσμίξεων και την ποσοτική πρόβλεψη· [9–11]
• Παραδείγματα παρακολούθησης διεργασιών ευθυγραμμισμένα με το PAT και γνωστά εμπόδια στη βιομηχανική μετάφραση. [3]

Αποτελέσματα

Σε όλες τις συγκεντρωμένες μελέτες, η Raman και η χημειομετρία διέκριναν νοθευμένα αιθέρια έλαια όταν η οπτική επιθεώρηση ήταν ανεπαρκής, με την PCA να παρέχει φασματικό διαχωρισμό μεταξύ καθαρών και νοθευμένων δειγμάτων. [9] Η ποσοτική μοντελοποίηση Raman (PLSR) πέτυχε υψηλά επίπεδα ακρίβειας πρόβλεψης σε εργασίες πρόβλεψης συγκέντρωσης, υποστηρίζοντας την πιθανότητα ποσοτικοποίησης βάσει βαθμονόμησης σε σύνθετα σκευάσματα. [10]

Για τα ιχνοστοιχεία προσμίξεων, οι μελέτες SERS ανέφεραν ανίχνευση έως και 1 ppm σε επιφάνειες φρούτων για επιλεγμένα εντομοκτόνα και, σε άλλη εργασία, μέτρησαν LODs που κυμαίνονταν από 0.001–10 ppm σε 21 εντομοκτόνα χρησιμοποιώντας κολλοειδή νανοσωματίδια χρυσού. [6, 7] Η φορητή SERS με εκχύλιση οξικού άλατος QuEChERS ανίχνευσε πολλαπλά εντομοκτόνα κάτω από το MRL της ΕΕ των 10 ppb σε ρύζι basmati για επιλεγμένους αναλύτες, με την εκχύλιση να ολοκληρώνεται σε λιγότερο από 15 min, απεικονίζοντας μια ρεαλιστική ροή εργασίας «πρώτης ανίχνευσης». [8]

Για χρήση PAT, οι γρήγορες, μη καταστροφικές, μη επεμβατικές μετρήσεις της Raman και η ικανότητα ανάπτυξής της από το εργαστήριο έως τις γραμμές παραγωγής υποστηρίζουν την inline/online παρακολούθηση. Ωστόσο, τα στοιχεία τονίζουν επίσης ότι η περισσότερη έρευνα PAT παραμένει σε εργαστηριακή κλίμακα και ότι τα μοντέλα διεργασιών Raman μπορεί να έχουν σχετικά υψηλά LODs που χάνουν στόχους χαμηλής συγκέντρωσης σε περιβάλλοντα παρακολούθησης εκχύλισης. [2, 3]

Συμπεράσματα

Τα στοιχεία υποστηρίζουν μια εφικτή ιδέα PAT με δυνατότητα Raman/SERS για τη διαχείριση κινδύνου προσμίξεων σε φυτικά APIs: ανάπτυξη φορητού Raman για την επαλήθευση γνησιότητας εισερχόμενων υλικών και την ανίχνευση προσμίξεων· χρήση μονάδων SERS για στοχευμένη ανίχνευση εντομοκτόνων· και ενσωμάτωση πολυμεταβλητών μοντέλων βασισμένων σε Raman σε βρόχους ελέγχου PAT όπου οι συνθήκες της διεργασίας επιτρέπουν σταθερή μεταφορά βαθμονόμησης και επαρκή ικανότητα ανίχνευσης. [3, 12]

Οι κύριοι περιορισμοί είναι η ευαισθησία για στόχους εξαιρετικά χαμηλών ιχνών σε ετερογενείς φυτικές μήτρες, ο φθορισμός και τα ασθενή σήματα Raman, καθώς και οι απαιτήσεις επικύρωσης/μεταφοράς μοντέλου που απαιτούνται για την κανονιστική αποδοχή προσεγγίσεων μειωμένων ή περιοδικών ελέγχων (skip testing). [3, 4, 13]

Λέξεις-κλειδιά

• Φασματοσκοπία Raman
• SERS
• Αναλυτική τεχνολογία διεργασιών
• Φυτικό API
• Υπολείμματα εντομοκτόνων
• Ανίχνευση προσμίξεων
• Χημειομετρία
• Παρακολούθηση σε πραγματικό χρόνο

Εισαγωγή

Οι φυτικές φαρμακευτικές ουσίες και τα φυτικά APIs ρυθμίζονται βάσει παραδειγμάτων ποιότητας που δίνουν έμφαση στη θεραπευτική συνέπεια υποστηριζόμενη από μια προσέγγιση «συνόλου των αποδεικτικών στοιχείων», συμπεριλαμβανομένου του ελέγχου των φυτικών πρώτων υλών και των δοκιμών χημικού ελέγχου ποιότητας που μπορούν να χρησιμοποιούν φασματοσκοπικές ή/και χρωματογραφικές μεθόδους. [1] Εντός αυτού του παραδείγματος, οι κίνδυνοι μόλυνσης και νόθευσης κατονομάζονται ρητά ως ζητήματα ποιότητας που απαιτούν στρατηγικές δοκιμών, συμπεριλαμβανομένων δοκιμών για υπολειμματικά εντομοκτόνα (συμπεριλαμβανομένων των μητρικών εντομοκτόνων και των κύριων τοξικών μεταβολιτών) και τυχαίων τοξινών όπως οι aflatoxins, καθώς και ελέγχους που αφορούν ξένα υλικά και προσμίξεις. [1]

Παράλληλα, οι ευρωπαϊκές οδηγίες προδιαγραφών για φυτικές ουσίες και παρασκευάσματα ορίζουν τις προδιαγραφές ως τις δοκιμές, τις διαδικασίες και τα κριτήρια αποδοχής που χρησιμοποιούνται για τη διασφάλιση της ποιότητας κατά την κυκλοφορία και κατά τη διάρκεια της διάρκειας ζωής, και προσδιορίζουν ομάδες προσμίξεων που πρέπει να αντιμετωπίζονται κατάλληλα, συμπεριλαμβανομένων των βαρέων μετάλλων/στοιχειακών προσμίξεων, των υπολειμμάτων εντομοκτόνων και υποκαπνιστικών, των μυκοτοξινών (aflatoxins, ochratoxin A) και της μικροβιακής μόλυνσης. [13, 14] Οι οδηγίες του EMA υποδεικνύουν επίσης ότι ο περιοδικός έλεγχος (skip testing) των υπολειμμάτων προσμίξεων μπορεί να είναι αποδεκτός όταν δικαιολογείται μέσω αξιολόγησης κινδύνου και δεδομένων παρτίδας, καθιερώνοντας ένα σαφές κανονιστικό κίνητρο για ταχύτερα εργαλεία ανίχνευσης και κατανόησης διεργασιών που μπορούν να δικαιολογήσουν στρατηγικές ελέγχου βάσει κινδύνου χωρίς να διακυβεύεται η ασφάλεια. [13]

Η φασματοσκοπία Raman είναι υποψήφια για τέτοιες στρατηγικές επειδή η σκέδαση Raman παρέχει χημικά ειδικά φάσματα «αποτυπώματος» (fingerprint), και οι μέθοδοι Raman πλαισιώνονται συνήθως ως ταχείες, μη καταστροφικές και μη επεμβατικές με απλή προετοιμασία δειγμάτων, οι οποίες είναι λειτουργικές ιδιότητες ευθυγραμμισμένες με τη λήψη αποφάσεων σε πραγματικό χρόνο κατά τη διάρκεια της κατασκευής και του ελέγχου της αλυσίδας εφοδιασμού. [2, 4]

Οι ανασκοπήσεις των φαρμακευτικών εφαρμογών Raman περιγράφουν ένα εύρος ανάπτυξης που εκτείνεται από την εργαστηριακή χρήση έως τις αποβάθρες παραλαβής και τις γραμμές παραγωγής, υποδηλώνοντας ότι η Raman μπορεί να θεωρηθεί όχι μόνο ως ένα εργαλείο αναγνώρισης εκτός σύνδεσης (off-line) αλλά και ως ένας δυνητικός αναλυτικός αισθητήρας εντός της διεργασίας (in-process) σε ένα πλαίσιο PAT. [2] Το PAT ορίζεται ρητά ως η χρήση μιας σειράς εργαλείων και μέσων για την πραγματοποίηση ανάλυσης σε πραγματικό χρόνο και ελέγχου ανάδρασης κατά τη διάρκεια της βιομηχανικής παραγωγής για τη διασφάλιση μιας ελεγχόμενης παραγωγικής διαδικασίας και βέλτιστης ποιότητας προϊόντος, και οι τεχνικές δονητικής φασματοσκοπίας περιγράφονται ως ικανές να επιτρέπουν την online, σε πραγματικό χρόνο και ταχεία ανίχνευση εσωτερικών χαρακτηριστικών ποιότητας των βοτάνων κατά την επεξεργασία. [3]

Ωστόσο, ο προσδιορισμός προφίλ ιχνοστοιχείων προσμίξεων στα φυτικά είναι αναλυτικά απαιτητικός και η βιβλιογραφία υποδεικνύει σημαντικές προκλήσεις μετάφρασης: η περισσότερη έρευνα PAT έχει διεξαχθεί σε εξοπλισμό εργαστηριακής κλίμακας όπου οι πειραματικές συνθήκες είναι ευκολότερο να ελεγχθούν, και τα μοντέλα διεργασιών που βασίζονται σε Raman μπορεί να έχουν σχετικά υψηλά LODs που αποτυγχάνουν να ανιχνεύσουν στόχους χαμηλής συγκέντρωσης σε προσομοιωμένες εργασίες παρακολούθησης εκχύλισης. [3] Αυτοί οι περιορισμοί παρακινούν ένα ερώτημα προσανατολισμένο στο σχεδιασμό για τα φυτικά APIs: πώς μπορεί η Raman (και η ενισχυμένη με SERS Raman) να αναπτυχθεί εντός ενός πλαισίου PAT έτσι ώστε να παρέχει ταχεία, μη καταστροφική ανίχνευση και, όπου είναι εφικτό, ποσοτικές προβλέψεις που είναι ανθεκτικές στη μεταβλητότητα της μήτρας και της διεργασίας, παραμένοντας ταυτόχρονα συμβατή με τις βασισμένες στον κίνδυνο κανονιστικές προσδοκίες για τον έλεγχο των προσμίξεων και την επικύρωση των μεθόδων; [2, 3, 13]

Αντίστοιχα, το ερευνητικό ερώτημα που εξετάζεται εδώ είναι: Μπορούν τα δημοσιευμένα στοιχεία απόδοσης Raman και SERS να υποστηρίξουν μια πρακτική αρχιτεκτονική PAT για τον προσδιορισμό προφίλ ιχνοστοιχείων προσμίξεων σε σχεδόν πραγματικό χρόνο σε φυτικά APIs που συμπληρώνει ή διαχωρίζει τις κλασικές επιβεβαιωτικές δοκιμασίες; [3, 6, 8] Η υπόθεση εργασίας είναι ότι ο βασισμένος στη Raman μη καταστροφικός προσδιορισμός αποτυπώματος θα είναι πιο αποτελεσματικός ως ένα κλιμακωτό σύστημα PAT: (i) Raman + χημειομετρία για ταχεία επαλήθευση γνησιότητας/ανίχνευση νόθευσης· (ii) στοχευμένες μονάδες SERS για ανίχνευση ιχνοστοιχείων εντομοκτόνων σε σχετικές μήτρες· και (iii) παρακολούθηση διεργασιών Raman για εσωτερικά χαρακτηριστικά ποιότητας όπου η ευαισθησία είναι επαρκής, με τον βασισμένο στον κίνδυνο περιοδικό έλεγχο (skip-testing) να δικαιολογείται από δεδομένα και το ιστορικό παρτίδων παρά μόνο από την ανάπτυξη του αισθητήρα. [3, 6, 9, 13]

Ποσοτική Πρόβλεψη και Συμπερασματολογία Βάσει Βαθμονόμησης

Για την ποσοτική πρόβλεψη και τη συμπερασματολογία βάσει βαθμονόμησης, μια μελέτη Raman σε σκευάσματα methyl eugenol νοθευμένα με xylene ανέφερε ότι η PCA ήταν χρήσιμη για τη διαφοροποίηση συνόλων φασματικών δεδομένων Raman διαφορετικών συγκεντρώσεων. Επιπλέον, ένα μοντέλο PLSR ήταν σε θέση να προβλέψει τη συγκέντρωση ενός άγνωστου δείγματος με αξιοπιστία, αποδεικνύοντας ότι ο συνδυασμός φασματοσκοπίας Raman και PLSR θα μπορούσε να επιτύχει υψηλή προγνωστική απόδοση. Αυτό υπογραμμίζει την πιθανή χρησιμότητά του στην ανάπτυξη ποσοτικών μοντέλων για γνωστού κινδύνου προσμίξεις σε φυτικά APIs όταν είναι διαθέσιμα υλικά αναφοράς [10].

Επιβεβαίωση Ταυτότητας σε Τελικά Προϊόντα

Μια μέθοδος Raman βασισμένη σε γραμμωτό κώδικα (barcode) έχει αποδειχθεί αποτελεσματική για την επιβεβαίωση της ταυτότητας των APIs σε τελικά προϊόντα. Η τεχνική λειτουργεί συγκρίνοντας το ποσοστό της μη μηδενικής επικάλυψης μεταξύ των αναμενόμενων barcodes του API και του τελικού φαρμακευτικού προϊόντος, όπου τα φάσματα μετασχηματίζονται για να δώσουν έμφαση στις κορυφές Raman [11]. Χρησιμοποιώντας αυτήν την προσέγγιση, 18 εγκεκριμένα τελικά φαρμακευτικά προϊόντα και εννέα προσομοιωμένα πλαστά ταυτοποιήθηκαν με ακρίβεια 100%. Αυτό υποστηρίζει τη σκοπιμότητα χρήσης της λογικής «επικάλυψης αποτυπώματος» βάσει Raman για ισχυρή επαλήθευση ταυτότητας σε τυποποιημένα προϊόντα, υπό την προϋπόθεση ότι εφαρμόζονται κατάλληλοι κανόνες μετασχηματισμού και λήψης αποφάσεων [11].

Ανάλυση Raman για Κινδύνους «Πανομοιότυπων» Βοτάνων

Προσεγγίσεις φασματικής υπογραφής Raman έχουν αναπτυχθεί για τη διάκριση γνήσιων δειγμάτων από νοθευμένα σε φυτικά πλαίσια. Για παράδειγμα, η ανάλυση δειγμάτων Phansomba/Phellinus αποκάλυψε σαφή διαχωρισμό μεταξύ γνήσιων και νοθευμένων δειγμάτων. Προσδιορίστηκαν βασικές ζώνες Raman (487, 528, 786, 892, 915 και 1436 cm) χαρακτηριστικές του Phellinus (ειδικά του Ph. merrillii), υποδηλώνοντας τη δυνατότητα δημιουργίας βάσεων δεδομένων με εύρη υπογραφών για ροές εργασίας επιθεώρησης σε άλλα φυτικά φάρμακα [21].

Ωστόσο, υπάρχουν περιορισμοί. Σε έναν έλεγχο 50 φυτικών συμπληρωμάτων διατροφής με ισχυρισμούς σεξουαλικής ενίσχυσης, η φασματοσκοπία Raman ανίχνευσε εννέα νοθευμένα δείγματα (τέσσερα με sildenafil και πέντε με tadalafil). Ωστόσο, απέτυχε να παράσχει οριστικά αποτελέσματα σχετικά με τη νόθευση με tadalafil σε δύο δείγματα, υποδεικνύοντας την ανάγκη για επιβεβαιωτικές μεθόδους ή ενισχυμένες στρατηγικές φασματικής ερμηνείας για ορισμένες περιπτώσεις [22].

4.2 Υπολείμματα Εντομοκτόνων μέσω SERS

Τα δημοσιευμένα στοιχεία υπογραμμίζουν ότι η SERS είναι μια ταχεία, μη καταστροφική τεχνική ικανή να ανιχνεύει εντομοκτόνα σε επίπεδα ιχνών (ppm ή ppb) σε ευθυγράμμιση με τα πρότυπα ελέγχου φυτικών προσμίξεων [1, 6, 19]. Μια μελέτη κατέδειξε την ικανότητα της SERS να ανιχνεύει εντομοκτόνα σε επιφάνειες φρούτων σε επίπεδα τόσο χαμηλά όσο 1 ppm, παρουσιάζοντας καλή συσχέτιση με τα κανονιστικά όρια υπολειμμάτων εντομοκτόνων για τα μήλα [6].

Ποσοτικές μελέτες SERS έχουν δείξει ισχυρή απόδοση βαθμονόμησης. Για παράδειγμα, μια μελέτη ανέφερε συντελεστές προσδιορισμού (R²) 0.99 για το omethoate και 0.98 για το chlorpyrifos, με όρια ανίχνευσης (LODs) 1.63 mg·cm και 2.64 mg·cm, αντίστοιχα. Αυτό υπογραμμίζει τη σκοπιμότητα μοντέλων βαθμονόμησης που χρησιμοποιούν χαρακτηριστικές εντάσεις κορυφής SERS για την ποσοτικοποίηση υπολειμμάτων [17]. Σε αυτή τη μελέτη, ειδικές για τον αναλύτη κορυφές Raman (413 cm για το omethoate, 346 cm για το chlorpyrifos) χρησιμοποιήθηκαν για τη χαρτογράφηση της συγκέντρωσης μέσω μοντέλων βαθμονόμησης [17].

Η SERS με κολλοειδή νανοσωματίδια χρυσού έχει ενισχύσει περαιτέρω τη σκέδαση Raman από 21 διαφορετικά εντομοκτόνα. Τα όρια ανίχνευσης κυμαίνονταν από 0.001 έως 10 ppm, με ταυτόχρονη ταυτοποίηση του phosmet και του thiram να επιτυγχάνεται σε φλούδα μήλου χρησιμοποιώντας PCA και SERS [7].

Για μήτρες φυλλωδών λαχανικών, οι καμπύλες βαθμονόμησης για υπολείμματα εντομοκτόνων των phosmet, thiabendazole και acetamiprid παρουσίασαν ισχυρούς γραμμικούς συντελεστές συσχέτισης, επιτυγχάνοντας ανακτήσεις μεταξύ 94.67% και 112.89%. Οι επικυρώσεις βάσει ανάκτησης ανέφεραν σχετικές τυπικές αποκλίσεις μεταξύ 3.87% και 8.56%. Ολόκληρη η διαδικασία δοκιμής, συμπεριλαμβανομένης της δειγματοληψίας, της ανάλυσης φάσματος και της ποσοτικής πρόβλεψης, ολοκληρώθηκε σε λιγότερο από πέντε λεπτά, μια σημαντική βελτίωση σε σχέση με τις παραδοσιακές χρωματογραφικές μεθόδους [16].

Σε ένα πλαίσιο φυτικής μήτρας, η SERS έδειξε δυνατότητες ανίχνευσης deltamethrin σε Corydalis. Η κύρια χαρακτηριστική κορυφή αναγνωρίστηκε στα 999 cm, με τις αυξήσεις στη μοντελοποίηση να αποδίδουν όριο ανίχνευσης τόσο χαμηλό όσο 0.186 mg/L για άμεση παρατήρηση στην κορυφή των 999 cm. Η χρήση ενός μοντέλου PLS πέτυχε επίσης καλές μετρικές προγνωστικής απόδοσης [23].

Οι φορητές συσκευές SERS, σε συνδυασμό με την εκχύλιση οξικού άλατος QuEChERS, απέδειξαν την ικανότητα ανίχνευσης πολλαπλών υπολειμμάτων εντομοκτόνων σε ρύζι basmati εντός 15 λεπτών. Εντομοκτόνα όπως τα CBM, THI και TRI ανιχνεύθηκαν κάτω από το μέγιστο όριο υπολειμμάτων (MRL) της ΕΕ των 10 ppb. Ωστόσο, το όριο ανίχνευσης για το ACE παρέμεινε περιορισμένο στα 800 ppb, υπογραμμίζοντας την πιθανή μεταβλητότητα στην ευαισθησία του αναλύτη εντός μιας ροής εργασίας πολλαπλών υπολειμμάτων [8].

Οι δυναμικές προσεγγίσεις SERS έχουν ενισχύσει την ευαισθησία σε πλαίσια σταγονιδίων (sessile-drop), επιτρέποντας την ανίχνευση paraquat, thiabendazole, tricyclazole και isocarbophos σε επίπεδα ppm και ppb. Αυτή η προσέγγιση εκμεταλλεύεται μια μετασταθή κατάσταση νανοσωματιδίων κατά τη διάρκεια της εξάτμισης για τη διατήρηση της διακριτότητας σε εμπλουτισμένα εκχυλίσματα λαχανικών. Οι γραμμικές σχέσεις μεταξύ των εντάσεων των χαρακτηριστικών κορυφών και των επιπέδων συγκέντρωσης επικυρώνουν περαιτέρω αυτή τη μέθοδο [18].

4.3 Προφίλ Μυκοτοξινών και Μικροβιακών Δεικτών

Τα κανονιστικά πρότυπα επιβάλλουν δοκιμές ποιότητας για μυκοτοξίνες και μικροβιολογικό έλεγχο για φυτικές ουσίες, εστιάζοντας ιδιαίτερα στις aflatoxins και την ochratoxin A [13, 24]. Για παράδειγμα, οι μονογραφίες του USP καθορίζουν μέγιστο όριο NMT 5 ppb για την aflatoxin B1 και NMT 20 ppb για το άθροισμα των aflatoxins B1, B2, G1 και G2 [19]. Αυτά τα όρια καθορίζουν την ευαισθησία που πρέπει να επιτυγχάνουν οι μέθοδοι ανίχνευσης και επιβεβαίωσης.

Λόγω της πρωταρχικής έμφασης στην ανίχνευση εντομοκτόνων Raman/SERS και στις εφαρμογές νόθευσης, αυτή η τεχνολογία είναι καλύτερα τοποθετημένη ως συμπληρωματικό εργαλείο ανίχνευσης στο πλαίσιο μιας ευρύτερης στρατηγικής ελέγχου προσμίξεων. Αυτό ευθυγραμμίζεται με τις κανονιστικές οδηγίες που προτείνουν ο έλεγχος ποιότητας να υποστηρίζεται από χημικές δοκιμές όπως η φασματοσκοπία ή η χρωματογραφία, ενσωματώνοντας παράλληλα αναδυόμενες τεχνολογίες [1, 13].

4.4 Συμπερασματολογία για Βαρέα Μέταλλα και Ανόργανες Προσμίξεις

Ο EMA απαιτεί δοκιμές για βαρέα μέταλλα και άλλες στοιχειακές προσμίξεις σε φυτικά φαρμακευτικά προϊόντα, εκτός εάν δικαιολογείται διαφορετικά, πλαισιώνοντας μια κανονιστική προσδοκία για τον προσδιορισμό προφίλ ιχνοστοιχείων προσμίξεων σε φυτικά APIs [13, 24].

Στην τρέχουσα βάση στοιχείων Raman/SERS, αυτές οι προσμίξεις αντιμετωπίζονται έμμεσα μέσω του βελτιωμένου ελέγχου της ταυτότητας των πρώτων υλών, της ταχύτερης ανίχνευσης νόθευσης και της ιεράρχησης των επιβεβαιωτικών δοκιμών για δείγματα υψηλού κινδύνου. Ωστόσο, οι μέθοδοι Raman δεν τοποθετούνται επί του παρόντος ως αυτόνομες μέθοδοι για την ποσοτικοποίηση στοιχειακών προσμίξεων χωρίς πρόσθετη επικύρωση ή συμπληρωματικές τεχνολογίες [1, 13, 21].

4.5 In-Line και On-Line Raman PAT για Φυτική Επεξεργασία

Το πλαίσιο της Αναλυτικής Τεχνολογίας Διεργασιών (PAT) χρησιμοποιεί ανάλυση σε πραγματικό χρόνο για τη βελτιστοποίηση της ποιότητας των προϊόντων και του ελέγχου των διεργασιών. Η φασματοσκοπία Raman περιγράφεται ως κατάλληλη για το σκοπό αυτό, προσφέροντας ταχεία, μη επεμβατική ανάλυση συμβατή με τις συνθήκες κατασκευής κατά τη διάρκεια της διεργασίας [3].

Ένα παράδειγμα Raman-PAT είναι η χρήση ενός μοντέλου RS-CARS-PLS για την παρακολούθηση των διαδικασιών εκχύλισης στην κατασκευή κοκκίων Wenxin. Ενώ το μοντέλο επέδειξε αποτελεσματική παρακολούθηση της διεργασίας, η ευαισθησία του για αναλύτες χαμηλής συγκέντρωσης, όπως οι σακχαρίτες, ήταν περιορισμένη—υπογραμμίζοντας την ανάγκη για SERS ή συμπληρωματικές τεχνικές για την ανίχνευση προσμίξεων σε επίπεδα ιχνών [3].

Η βιομηχανική ανάπτυξη θέτει πρόσθετες προκλήσεις, καθώς η περισσότερη έρευνα PAT πραγματοποιείται σε περιβάλλοντα ελεγχόμενα από εργαστήριο. Η στιβαρότητα και ο έλεγχος της μεταβλητότητας πρέπει να αντιμετωπιστούν για την επιτυχή κλιμάκωση και τη ζωντανή εφαρμογή [3].

4.6 Συγκριτική Αναλυτική Απόδοση

Η συμβατική φασματοσκοπία Raman παρέχει ταχεία, μη καταστροφικά χημικά αποτυπώματα χωρίς να απαιτείται προεπεξεργασία δείγματος. Αντίθετα, η SERS ενισχύει την ευαισθησία για την ανίχνευση προσμίξεων σε επίπεδα ιχνών, επιτυγχάνοντας όρια ανίχνευσης από 1 ppm έως και 0.001 ppm για ορισμένα εντομοκτόνα ανάλογα με τη μέθοδο και τη μήτρα [4, 5, 6, 7]. Για παράδειγμα, η SERS σε συνδυασμό με βαθμονόμηση κατέδειξε ανίχνευση εντομοκτόνων σε φυλλώδη λαχανικά με συντελεστές συσχέτισης έως 0.98291 και ολοκλήρωση της συνολικής ροής εργασίας σε μόλις πέντε λεπτά [16].

Για εφαρμογές επαλήθευσης γνησιότητας, η PCA ήταν χρήσιμη στη διαφοροποίηση λεπτών φασματικών παραλλαγών σε αιθέρια έλαια, και οι τεχνικές Raman που βασίζονται σε barcodes έδειξαν ακρίβεια 100% στην ταυτοποίηση πλαστών και αυθεντικών τελικών προϊόντων [9–11].

4.7 Φορητά Όργανα και Όργανα Χειρός για τον Έλεγχο Πρώτων Υλών

Τα φορητά όργανα Raman τοποθετούνται ως χρονικά αποδοτικά, μη καταστροφικά εργαλεία ικανά να αναλύουν γρήγορα φυτικά υλικά χωρίς την ανάγκη περίπλοκης προετοιμασίας. Είναι επίσης εφαρμόσιμα για την παρακολούθηση της συμμόρφωσης με την υγεία και την ασφάλεια σε φυτικά προϊόντα, προσφέροντας ένα πολύτιμο εργαλείο τόσο για τον έλεγχο εντός του εργοστασίου όσο και για τον έλεγχο μετά την κυκλοφορία στην αγορά [12].

Οι κανονιστικές οδηγίες από τον FDA υπογραμμίζουν αναδυόμενες μεθόδους όπως η φασματοσκοπία Raman κατευθυνόμενης μορφολογίας (MDRS) ως χρήσιμες για εργασίες όπως ο χαρακτηρισμός της κατανομής μεγέθους σωματιδίων όταν υποστηρίζονται από αυστηρή επικύρωση. Αν και δεν είναι ειδικές για φυτικά APIs, αυτές οι μέθοδοι καταδεικνύουν την ικανότητα της Raman να συμπληρώνει τις παραδοσιακές αναλυτικές τεχνικές [25, 26].

Συζήτηση

Τα συνθετικά στοιχεία υποστηρίζουν τη Raman και τη SERS ως πολύτιμα εργαλεία για μη καταστροφική, ταχεία ανίχνευση και παρακολούθηση σε πραγματικό χρόνο εντός περιβαλλόντων PAT. Αυτές οι τεχνολογίες μπορούν να ενσωματωθούν αποτελεσματικά στις ροές εργασίας ελέγχου προσμίξεων και διασφάλισης ποιότητας για φυτικά APIs [2, 3, 5].

5.1 Πλεονεκτήματα των Raman και PAT έναντι των Κλασικών Καταστροφικών Μεθόδων

Η φασματοσκοπία Raman είναι πλεονεκτική για την ταχύτητά της, τις μη καταστροφικές ιδιότητές της και τις ελάχιστες απαιτήσεις προετοιμασίας δειγμάτων. Η SERS επεκτείνει αυτή τη χρησιμότητα, επιτρέποντας την ανίχνευση σε επίπεδα ιχνών μέσω μηχανισμών ενίσχυσης, η οποία έχει αποδειχθεί ότι ανιχνεύει εντομοκτόνα σε επίπεδα ppb με γρήγορους συνολικούς χρόνους ροής εργασίας, καθιστώντας την ιδανική για την αρχική ανίχνευση και τη διαλογή δειγμάτων για επιβεβαιωτικές δοκιμές [2, 4, 5, 16].

5.2 Περιορισμοί

Οι βασικοί περιορισμοί περιλαμβάνουν προκλήσεις ευαισθησίας στις μεθόδους Raman βάσης, ειδικά για αναλύτες χαμηλής συγκέντρωσης χωρίς ενίσχυση SERS. Η βιομηχανική χρήση του PAT που βασίζεται σε Raman απαιτεί επίσης την υπέρβαση των προκλήσεων της μεταβλητότητας και της ισχυρής κλιμάκωσης. Επιπλέον, κάποια εξάρτηση από χημειομετρικά μοντέλα, όπως η PCA και η PLS, εισάγει πολυπλοκότητα και πιθανή αβεβαιότητα ανάλογα με τη μεταβλητότητα της μήτρας και την εκπαίδευση του μοντέλου [3, 9, 22, 23].

Κανονιστικές Οδηγίες και Εργαλεία Ανίχνευσης Βασισμένα στη Raman

Οι κανονιστικές οδηγίες υποστηρίζουν μια προσέγγιση ποιότητας για τα φυτικά που βασίζεται στο σύνολο των αποδεικτικών στοιχείων, συμπεριλαμβανομένου του ελέγχου των φυτικών πρώτων υλών και των δοκιμών χημικού ελέγχου ποιότητας χρησιμοποιώντας φασματοσκοπικές ή/και χρωματογραφικές μεθόδους. Αυτό παρέχει μια εννοιολογική διαδρομή για την ενσωμάτωση εργαλείων ανίχνευσης που βασίζονται στη Raman σε συνολικές στρατηγικές ελέγχου, αντί να αντιμετωπίζονται ως αυτόνομες αντικαταστάσεις για όλες τις κλασικές δοκιμασίες. [1]

Οι οδηγίες του FDA ζητούν ρητά δοκιμές για υπολειμματικά εντομοκτόνα και τυχαίες τοξίνες όπως οι aflatoxins, καθώς και ξένα υλικά και προσμίξεις. Αυτό ευθυγραμμίζεται με τις δυνατότητες Raman/SERS στην ανίχνευση εντομοκτόνων και προσμίξεων, ενισχύοντας την ανάγκη για κάλυψη κατηγοριών προσμίξεων σε ένα ολοκληρωμένο πρόγραμμα ελέγχου. [1]

Ο FDA δηλώνει επίσης ότι οι αιτούντες θα πρέπει να αξιολογούν τις τρέχουσες και αναδυόμενες τεχνολογίες και να αναπτύσσουν ορθογώνιες αναλυτικές μεθόδους για την παροχή επαρκούς ταυτοποίησης και ποσοτικοποίησης. Αυτό μπορεί να ερμηνευθεί ως υποστηρικτικό για την ανάπτυξη Raman/SERS ως μέρος ενός συνόλου ορθογώνιων μεθόδων σε συνδυασμό με επιβεβαιωτικές μεθόδους όπως η LC–MS ή άλλες δοκιμασίες για οριστική ποσοτικοποίηση, ειδικά όπου η απόδοση της SERS εξαρτάται από τον έλεγχο της προεπεξεργασίας του δείγματος για ακριβή ποσοτικοποίηση σε σχέση με την LC–MS. [1, 27] Υποστηρίζοντας αυτή την άποψη, μια μελέτη που συνέκρινε τη SERS και την LC–MS για ένα μη αναμενόμενο ζιζανιοκτόνο σε μια περίπλοκη μήτρα ανέφερε ότι η SERS παρουσίασε υψηλή ευαισθησία και υψηλότερη απόδοση ανίχνευσης για ανίχνευση στόχων εξαιρετικά χαμηλών ιχνών, ενώ η LC–MS παρείχε ακριβέστερη ποσοτικοποίηση διευκολυνόμενη από καλά ελεγχόμενη προεπεξεργασία δείγματος. Αυτό παρακινεί μια κλιμακωτή αρχιτεκτονική: SERS για ταχεία ευαίσθητη ανίχνευση και LC–MS για επιβεβαιωτική ποσοτικοποίηση. [27]

Στην ΕΕ, οι οδηγίες προδιαγραφών του EMA ορίζουν τις προδιαγραφές και προσδιορίζουν τις ομάδες προσμίξεων που πρέπει να αντιμετωπίζονται (συμπεριλαμβανομένων των βαρέων μετάλλων, των υπολειμμάτων εντομοκτόνων, των μυκοτοξινών, της μικροβιακής μόλυνσης). Επιτρέπει τον περιοδικό έλεγχο (skip testing) όπου δικαιολογείται από την αξιολόγηση κινδύνου και τα δεδομένα παρτίδων, υποδηλώνοντας ότι οι ροές δεδομένων Raman/PAT θα μπορούσαν να συνεισφέρουν υποστηρικτικά στοιχεία για στρατηγικές δοκιμών βάσει κινδύνου εάν επικυρωθούν και αποδειχθεί ότι ανιχνεύουν σχετικές αποκλίσεις εγκαίρως. [13, 14]

5.4 Στρατηγική Ανάπτυξης Βάσει Κινδύνου και Διαχείριση Κύκλου Ζωής

Οι οδηγίες του USP υποδεικνύουν ότι η έκταση των δοκιμών μπορεί να καθοριστεί χρησιμοποιώντας μια προσέγγιση βάσει κινδύνου που εξετάζει την πιθανότητα μόλυνσης. Αυτό υποστηρίζει μια στρατηγική όπου η ένταση ανίχνευσης Raman/SERS και οι επιβεβαιωτικές δοκιμές κατανέμονται με βάση παράγοντες κινδύνου όπως η πηγή, η γεωγραφία, το ιστορικό παρτίδων και τα προηγούμενα δεδομένα ανίχνευσης. [19] Ο EMA ομοίως υποδεικνύει ότι ο περιοδικός έλεγχος (skip testing) μπορεί να είναι αποδεκτός όπου δικαιολογείται, και ότι η αιτιολόγηση θα πρέπει να λαμβάνει υπόψη το φυτικό υλικό, τις συνθήκες καλλιέργειας/παραγωγής, τη μόλυνση από γειτονικές εκμεταλλεύσεις, τη γεωγραφική προέλευση και να υποστηρίζεται από αξιολόγηση κινδύνου και δεδομένα παρτίδων, ενισχύοντας την ανάγκη για συστήματα παρακολούθησης πλούσια σε δεδομένα αντί για ad hoc μειώσεις δοκιμών. [13]

Εντός αυτού του πλαισίου βάσει κινδύνου, το PAT που βασίζεται στη Raman μπορεί να τοποθετηθεί ως γεννήτρια γρήγορων, επαναλήψιμων αποτυπωμάτων και αποτελεσμάτων ανίχνευσης που υποστηρίζουν την παρακολούθηση τάσεων και την ταχεία αναγνώριση μη φυσιολογικών παρτίδων, ενώ οι επιβεβαιωτικές δοκιμασίες προορίζονται για παρτίδες που επισημαίνονται από την ανίχνευση ή για περιοδική επαλήθευση της απόδοσης του συστήματος ανίχνευσης και της σταθερότητας της βαθμονόμησης. [2, 13] Η μέθοδος ταυτότητας API που βασίζεται σε barcode και η φορητή ανίχνευση νόθευσης αιθέριων ελαίων απεικονίζουν πώς οι ισχυροί κανόνες λήψης αποφάσεων (επικάλυψη barcode, έντονες διαγνωστικές ζώνες) μπορούν να απλοποιήσουν τις αποφάσεις ανίχνευσης σε ορισμένα πλαίσια, ενώ η διάκριση βάσει PCA υποδεικνύει πού απαιτούνται πολυμεταβλητά μοντέλα για τη διατήρηση της ευαισθησίας σε λεπτά πρότυπα νόθευσης. [9, 11, 20]

Η διαχείριση του κύκλου ζωής για τις μεθόδους Raman υπονοείται επίσης από τις παρατηρήσεις του FDA σχετικά με τις υποβολές MDRS: η έλλειψη δεδομένων επικύρωσης για την επαναληψιμότητα και την ακρίβεια αποτελεί έλλειψη, τονίζοντας ότι οι μέθοδοι PAT που βασίζονται στη Raman πρέπει να αναπτύσσονται με την επικύρωση και την τεκμηρίωση της απόδοσης ως κεντρικά παραδοτέα για τις κανονιστικές αλληλεπιδράσεις. [25]

5.5 Προοπτική

Τα στοιχεία υποδηλώνουν πολλαπλές τεχνικές κατευθύνσεις για την αύξηση της σκοπιμότητας του PAT βάσει Raman για ιχνοστοιχεία προσμίξεων. Πρώτον, η αυξημένη ποικιλία τεχνικών (Fourier transform Raman, resonance Raman, confocal Raman και SERS) περιγράφεται ως εφικτή για την ενίσχυση των σημάτων Raman και την εξέλιξη των οργάνων και της επεξεργασίας δειγμάτων, υποστηρίζοντας μια στρατηγική επιλογής παραλλαγών τεχνικής ανάλογα με τη μήτρα και τις ανάγκες ευαισθησίας, αντί για την εξάρτηση από μια ενιαία διαμόρφωση Raman σε όλες τις φυτικές διεργασίες. [4]

Δεύτερον, η επιλεκτικότητα SERS μπορεί να ενισχυθεί με τη λειτουργικοποίηση νανοδομών με μόρια υποδοχείς όπως τα aptamers, υποδεικνύοντας μια διαδρομή προς στοχευμένες δοκιμασίες ιχνοστοιχείων προσμίξεων ενσωματωμένες σε μονάδες PAT όπου η παρεμβολή είναι κυρίαρχος κίνδυνος. [5]

Τρίτον, οι προσεγγίσεις SERS που βασίζονται στην απεικόνιση περιγράφονται ως ικανές να επιτρέπουν την παρακολούθηση σε πραγματικό χρόνο και την ανίχνευση του εντοπισμού της μόλυνσης στις επιφάνειες των φυτικών ιστών ή στο εσωτερικό τους, υποδηλώνοντας ότι οι μελλοντικές ροές εργασίας φυτικών APIs θα μπορούσαν να ενσωματώσουν χωρικά αναλυμένη χαρτογράφηση μόλυνσης για υλικά υψηλού κινδύνου ή για διερευνήσεις των οδών μόλυνσης. [5] Τέλος, το πρακτικό δυναμικό ανάπτυξης υποστηρίζεται από συμπεράσματα ότι η SERS θα μπορούσε να εφαρμοστεί περαιτέρω σε εργαλεία ταχείας και επιτόπιας ανίχνευσης για την ασφάλεια των τροφίμων και την παρακολούθηση του περιβάλλοντος, και από στοιχεία ότι τα φορητά όργανα Raman μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την παρακολούθηση της συμμόρφωσης με την υγεία και την ασφάλεια των φυτικών προϊόντων στην καταναλωτική αγορά, υπογραμμίζοντας μια συνέχεια από την ανίχνευση πεδίου έως τα συστήματα PAT κατασκευής. [12, 27]

6. Συμπεράσματα

Αυτή η εννοιολογική μελέτη σύνθεσης στοιχείων υποδεικνύει ότι η φασματοσκοπία Raman είναι καλά ευθυγραμμισμένη με τους στόχους του PAT επειδή είναι ταχεία, μη καταστροφική, μη επεμβατική και απλή στην προετοιμασία δειγμάτων. Οι εφαρμογές Raman περιγράφονται ως εκτεινόμενες από το εργαστήριο έως τις γραμμές παραγωγής, υποστηρίζοντας μια άποψη κύκλου ζωής της μέτρησης βάσει Raman από τον έλεγχο των εισερχόμενων πρώτων υλών έως την παρακολούθηση κατά τη διάρκεια της διεργασίας. [2]

Το PAT ορίζεται ρητά ως η δυνατότητα ανάλυσης σε πραγματικό χρόνο και ελέγχου ανάδρασης για τη διασφάλιση ελεγχόμενων παραγωγικών διαδικασιών και βέλτιστης ποιότητας. Η δονητική φασματοσκοπία περιγράφεται ως ικανή να επιτρέπει την online σε πραγματικό χρόνο ταχεία ανίχνευση της εσωτερικής ποιότητας των βοτάνων κατά την επεξεργασία, παρέχοντας μια εννοιολογική βάση για την τοποθέτηση αισθητήρων Raman στη φυτική κατασκευή. [3]

Για τα ιχνοστοιχεία προσμίξεων, η SERS παρέχει την ισχυρότερη βάση στοιχείων για την ευαισθησία, με την ενίσχυση να φτάνει δυνητικά σε όρια ανίχνευσης εξαιρετικά χαμηλών ιχνών σε ευγενή μέταλλα, και με πολλαπλές μελέτες εντομοκτόνων να καταδεικνύουν καθεστώτα ανίχνευσης ppm-to-ppb και ακόμη και χαμηλών nanomolar με μετρικές ποσοτικοποίησης και γρήγορες ροές εργασίας (π.χ. 5 min συνολικός χρόνος δοκιμής· <15 min εκχύλιση). [5, 8, 16, 18] Η χημειομετρία είναι απαραίτητη για πολλές εργασίες αυθεντικότητας και ποσοτικοποίησης, καθώς η οπτική επιθεώρηση μπορεί να είναι ανεπαρκής για την ανίχνευση νόθευσης, ενώ η PCA και η PLSR έχουν επιδείξει επιδόσεις διάκρισης και ποσοτικής πρόβλεψης. [9, 10]

Οι κύριοι περιορισμοί για τον προσδιορισμό προφίλ ιχνοστοιχείων προσμίξεων σε πραγματικό χρόνο σε φυτικά APIs είναι οι περιορισμοί ευαισθησίας στα μη ενισχυμένα μοντέλα διεργασιών PAT Raman (που απεικονίζονται από σχετικά υψηλά LODs στην παρακολούθηση εκχύλισης) και οι προκλήσεις στιβαρότητας/επικύρωσης για την κλιμάκωση του PAT από το εργαστήριο στην παραγωγή, μαζί με την αβεβαιότητα που προέρχεται από τη μήτρα σε ορισμένες περιπτώσεις ανίχνευσης προσμίξεων. [3, 22] Κατά συνέπεια, η πιο υπερασπίσιμη λειτουργική σύσταση που υποστηρίζεται από τα στοιχεία είναι μια κλιμακωτή αρχιτεκτονική PAT:

1. Φορητό Raman + χημειομετρία για ταχεία επαλήθευση γνησιότητας/ανίχνευση νόθευσης.
2. Στοχευμένες δοκιμασίες SERS για υπολείμματα εντομοκτόνων υψηλού κινδύνου.
3. Επιβεβαιωτικές ορθογώνιες μέθοδοι όπου η ποσοτικοποίηση και η λήψη κανονιστικών αποφάσεων απαιτούν υψηλότερη διασφάλιση, σύμφωνα με τις κανονιστικές προσδοκίες για ορθογώνιες μεθόδους και την αιτιολόγηση βάσει κινδύνου για τον περιοδικό έλεγχο (skip testing). [1, 5, 12, 13, 27]

Χρηματοδότηση

Καμία εξωτερική χρηματοδότηση. [1]

Σύγκρουση Συμφερόντων

Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχει σύγκρουση συμφερόντων. [1]

Δήλωση Διαθεσιμότητας Δεδομένων

Όλα τα δεδομένα που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή την εννοιολογική μελέτη προέρχονται από τις αναφερόμενες δημοσιευμένες πηγές και τα κανονιστικά έγγραφα που συντέθηκαν στο παρόν. [1, 14]

Εικόνα 1

Εικόνα 1. Εννοιολογική ροή εργασίας PAT για τη διαχείριση κινδύνου προσμίξεων φυτικών APIs με ενσωμάτωση μη καταστροφικής Raman και SERS: ανίχνευση εισερχόμενης φυτικής πρώτης ύλης χρησιμοποιώντας ταχύ, μη καταστροφικό προσδιορισμό αποτυπώματος Raman σε σημεία παραλαβής/αποβάθρας· χημειομετρικοί έλεγχοι γνησιότητας/νόθευσης (π.χ. διάκριση βάσει PCA, επιβεβαίωση ταυτότητας επικάλυψης barcode) για διασφάλιση ταυτότητας· στοχευμένες μονάδες SERS για ανίχνευση ιχνοστοιχείων εντομοκτόνων και ταχεία ποσοτική πρόβλεψη (ευαισθησία ppm-to-ppb με σύντομους χρόνους μέτρησης)· παρακολούθηση Raman κατά τη διάρκεια της διεργασίας σε μονάδες παραγωγής πλαισιωμένη υπό το PAT ως ανάλυση σε πραγματικό χρόνο και έλεγχο ανάδρασης· και αποφάσεις περιοδικής επαλήθευσης/skip-testing βάσει κινδύνου υποστηριζόμενες από το ιστορικό παρτίδων και επίσημες αξιολογήσεις κινδύνου σύμφωνα με τις οδηγίες EMA/USP. [2, 3, 6, 9, 11, 13, 16, 19]

Πίνακας 2

Πίνακας 3