Резюме
TOTOX 26 в добавках омега-3: происхождение лимита, кинетика окисления, условия хранения, токсикология и клинические данные
TOTOX (иногда записываемый как ToTox) — это окислительный индекс качества масел с омега-3, рассчитываемый как (или ), где PV в первую очередь отражает содержание пероксидов/гидропероксидов (первичных продуктов), а AV/p-AV отражает содержание вторичных продуктов окисления (преимущественно альдегидов). Он предназначен для синтетической оценки «общего» окисления[1–3].
Число «26» функционирует в первую очередь как предел/спецификация качества в отраслевых стандартах и монографиях (GOED, Codex CXS 329-2017, USP), а не как токсикологически обоснованный порог безопасности; особо подчеркивается, что лимитов окисления рыбьего жира, установленных на основе безопасности, не существует[1, 4–6]. На практике в благоприятных условиях (кислород, свет, температура) окисление может протекать быстро, и «абсолютная» стабильность в реальных условиях недостижима — ее можно лишь существенно замедлить путем контроля уровня кислорода, температуры, освещенности и использования антиоксидантов[7–9].
Токсикологические и клинические данные противоречивы и в настоящее время не позволяют определить конкретный уровень TOTOX, при котором «омега-3 становится провоспалительной» для человека; в то же время существуют механистические основания предполагать, что продукты окисления могут активировать воспалительные пути через окислительный стресс и NF-κB, а длительное воздействие продуктов окисления в дозах, содержащихся в биологически активных добавках, иногда оценивается как потенциально неблагоприятное[10, 11]. С другой стороны, цитируемое RCT с использованием масел с уровнями TOTOX около 45 по сравнению с 11 не показало статистически значимых различий в маркерах перекисного окисления липидов, воспаления и окислительного стресса в течение нескольких недель[12].
Происхождение стандарта TOTOX 26
Индекс TOTOX определяется как взвешенная сумма PV и AV/p-AV, чаще всего в виде или , что напрямую следует из монографии USP и описаний методов отчетности TOTOX в исследованиях качества пищевых добавок[1, 2, 13]. Обзорная литература, описывающая практику измерений, подчеркивает, что TOTOX является мерой «общего окисления», используемой в качестве показателя прогоркания, и иногда называется «условным» в смысле конструкции, объединяющей два теста в одно число[3].
В представленных источниках данный лимит прочно укоренен в стандартах качества, которые возникли в ответ на отсутствие единого стандарта для быстрорастущего рынка рыбьего жира. GOED (Global Organization for EPA and DHA Omega-3s) описывает требования к производителям-членам организации по выпуску масел, богатых омега-3, соответствующих следующим лимитам: PV < 5 meq O_2/kg, p-AV < 20 и TOTOX < 26[4]. Кроме того, исторические материалы указывают на то, что монография (созданная на основе работы группы в Council for Responsible Nutrition, предшественнике GOED) функционирует как «отраслевое определение качества с 2002 года», что объясняет индустриальное происхождение лимитов и их цель стандартизации[14].
Параллельно лимит ToTox/TOTOX = 26 фигурирует в стандарте Codex Alimentarius для рыбьих жиров (CXS 329-2017), где указано, что параметр ToTox («общее окисление масла») был установлен во избежание ситуаций, когда первичные и вторичные продукты окисления одновременно присутствуют в максимальных концентрациях, и приводится набор лимитов: PV ≤ 5, AV ≤ 20 и ToTox ≤ 26[5]. Аналогичным образом, в монографии USP для «Fish Oil containing Omega-3 Acids» прямо указано: TOTOX «не более 26» и приведена формула[1].
Регуляторные и обзорные материалы одновременно подчеркивают, что информация о параметрах окисления рыбьего жира для потребления ограничена, а EFSA в своем заключении 2010 года заявило о нехватке данных об уровнях окисления (PV и анизидиновое число) и связанных с ними токсикологических эффектах у человека[8, 15]. В этом смысле показатель «26» является в первую очередь спецификацией для контроля качества и технологического процесса/свежести, а не клинически обоснованным порогом безопасности[6, 8].
В таблице ниже обобщены наиболее значимые лимиты и контекст их применения из цитируемых источников.
Как быстро увеличивается окисление
Окисление омега-3 — это сложный и многофакторный процесс, зависящий от таких факторов, как состав жирных кислот, воздействие кислорода и света, температура, содержание антиоксидантов, а также присутствие воды и тяжелых металлов (катализ)[8]. Кроме того, этот процесс описывается как ускоряющаяся цепная реакция, при которой даже небольшие количества пероксидов в исходном масле или воздействие окисляющих факторов могут «кардинально» повлиять на скорость окисления n-3 PUFA[7].
Приблизительно (эмпирическое правило), скорость химических реакций удваивается при повышении температуры на 10°C, что также приводится и для окисления липидов[17, 18]. Эта эвристика не заменяет экспериментальные данные, но объясняет, почему транспортировка и хранение при более высоких температурах могут существенно ускорить рост PV/p-AV/TOTOX[17, 19].
Точные количественные данные получены в ходе экспериментов по ускоренному окислению, в которых сравнивались различные «условия окисления» и разные масла. В условиях непрерывного барботирования кислородом (99.5% O_2) в течение 30 дней при стандартном люминесцентном освещении и комнатной температуре PV увеличился примерно на 7 meq O_2/kg всего за 1 день и достиг 126 meq O_2/kg через 30 дней (для жира печени хоки), что сопровождалось крайне высоким уровнем TOTOX = 295.7 через 30 дней[20]. При «термическом окислении» при 50°C в темноте (без облучения), но в контакте с воздухом через 30 дней PV составлял 36.3 ± 1.6 meq O_2/kg (для хоки) и 43.2 ± 2.7 meq O_2/kg (для анчоуса), а TOTOX для хоки составил 117.4 (что значительно ниже, чем в условиях O_2 + свет)[20].
В тех же экспериментах по мере прогрессирования окисления сообщалось о снижении «периода индукции» (времени, необходимого для преодоления устойчивости к окислению): для жира хоки он составлял около 3 часов в начале, а через 30 дней снизился до < 1 часа, что демонстрирует склонность окисления к самораспространению по мере расходования антиоксидантного «буфера» и накопления продуктов реакции[21].
В случае пищевых добавок значение также имеют форма выпуска продукта и поведение потребителя. В исследовании, сравнивающем капсулы, жевательные формы и сиропы (хранившиеся при комнатной температуре и в темноте), максимальные показатели в конце периода хранения были значительно выше в сиропах (PV до 44.6 meq/kg масла; TOTOX до 96.94), чем в капсулах (PV до 7.62; TOTOX до 30.44), при этом жевательные формы имели промежуточные значения (PV до 26.14; TOTOX до 65.76)[20]. В любом случае, обзоры подчеркивают, что частое открывание флакона, большая площадь контакта масла с воздухом и ненадлежащие условия (комнатная температура, свет) ускоряют рост PV и p-AV, а следовательно, и TOTOX[19].
В дополнение к этому приводятся данные о «жизненном цикле продукта»: при наблюдении за пятью продуктами, у которых оставалось менее одного года до окончания срока годности, при повторном тестировании год спустя содержание EPA и DHA существенно не изменилось, однако показатели PV, p-AV и TOTOX выросли, причем PV и TOTOX приблизились к лимитам 5 meq O_2/kg и 26[9]. Это подтверждает вывод о том, что даже при стабильном содержании EPA/DHA окислительное качество может ухудшаться в процессе хранения[9].
На уровне рынка исследования качества добавок показали, что значительная часть продуктов превышала лимиты GOED: 38% превысили лимит PV = 5 meq O_2/kg, а среди несладких добавок 33% превысили лимит TOTOX = 26[22]. В то же время другое исследование рынка (для иного набора лимитов) показало, что 96% укладывались в менее строгий лимит TOTOX = 50, что демонстрирует сильную зависимость процента «несоответствия» от принятой спецификации[23].
Что должно произойти, чтобы TOTOX не увеличивался
На практике «остановка» роста TOTOX (отсутствие накопления продуктов окисления) в реальных условиях признана абсолютно недостижимой; однако этот процесс можно значительно замедлить, снизив воздействие факторов, инициирующих и поддерживающих окисление[9]. Поскольку скорость и глубина окисления зависят от кислорода, света, температуры, антиоксидантов, а также присутствия воды и тяжелых металлов, эффективная стратегия требует одновременного воздействия на несколько «рычагов»[8, 24].
Во-первых, критически важно минимизировать доступ кислорода. Технологические рекомендации предписывают хранить масла в безвоздушной среде («air-free») и заполнять свободное пространство в контейнере/капсуле азотом (N_2) или аргоном, что снижает доступ O_2 к липидной фазе[17]. В аналитических протоколах, минимизирующих дальнейшее окисление, методы включали хранение под «азотной подушкой» («N_2 blanket») и быстрый анализ (в течение 30 минут после экстракции), что указывает на то, что даже кратковременное воздействие кислорода может повлиять на результаты и фактические изменения[7].
Во-вторых, ограничение доступа света и снижение температуры имеют измеримое значение. Рекомендуется хранить добавки с омега-3 в прохладном и темном месте, а жидкие масла — предпочтительно в холодильнике, что согласуется с правилом ускорения реакций при повышении температуры и ролью света как фактора, инициирующего окисление[17, 19]. Также указывается, что стеклянная и пластиковая упаковка блокирует УФ-излучение, а другие материалы могут повысить защиту от излучения[17].
В-третьих, антиоксиданты работают наиболее эффективно, если они добавлены до начала окисления и образования пероксильных радикалов; однако введение антиоксидантов в уже окисленные масла приносит ограниченную пользу, если цепная реакция уже запущена[17]. В качестве наиболее важных антиоксидантов упоминаются токоферолы, также используются экстракты (например, розмарина), аскорбаты и лимонная кислота; последняя способна хелатировать ионы металлов, катализирующие окисление, и эффективно задерживать ухудшение окислительного качества[17].
В-четвертых, лекарственная форма имеет значение для контакта масла с кислородом и светом. В обзорах подчеркивается, что желатиновые капсулы благодаря герметичному «запечатыванию» масла ограничивают прямой контакт липидов с атмосферным кислородом и снижают воздействие света; во многих исследованиях отмечаются более низкие показатели PV/p-AV/TOTOX в капсулированных продуктах по сравнению с жидкими формами — особенно после длительного хранения[19]. С другой стороны, даже в контролируемых условиях «темнота + комнатная температура» сиропы демонстрировали самые высокие значения PV и TOTOX в конце хранения, что доказывает существенное влияние упаковки и особенностей использования (открывание, свободный объем над продуктом, время) на траекторию окисления[20].
Токсикология продуктов окисления
Окисление масел омега-3 приводит к образованию смеси первичных и вторичных продуктов. Цитируемые источники описывают, что по мере прогрессирования окисления количество неокисленных жирных кислот снижается, и появляется сложная смесь вторичных продуктов (включая альдегиды и кетоны) и пероксидов («жидких пероксидов»)[24]. Также подчеркивается, что первичные гидропероксиды могут распадаться на вторичные продукты, включая высокореактивные и цитотоксичные 4-hydroxy-2-alkenals, а пероксиды липидов могут распадаться до таких альдегидов, как 4-hydroxyhexenal (HHE) и malondialdehyde (MDA)[10, 25].
С токсикологической точки зрения α,β-unsaturated aldehydes (например, HNE/HOE) и другие низкомолекулярные альдегиды представляют особый интерес, поскольку в одном из обзоров указывалось, что HNE и HOE относятся к числу наиболее токсичных, а HHE — к наименее токсичным в данном классе соединений[15]. Для HNE приводились пороги генотоксичности > 0.1 μM и частичное ингибирование синтеза ДНК и белков в диапазоне 1–20 μM, а для acrolein — LD50 для клеток млекопитающих = 20 μM и значительное снижение колониеобразующей способности при концентрации около 1 μM[15]. Эти значения наглядно иллюстрируют, что отдельные продукты окисления могут быть биологически активными в низких концентрациях в клеточных моделях, хотя это не переносится автоматически на пищевые дозы и реальное воздействие на организм[15].
Модели на животных показывают, что вскармливание окисленными PUFAs может вызывать нежелательные эффекты, включая задержку роста, раздражение кишечника, увеличение печени и почек, гемолитическую анемию, снижение уровня витамина E, повышение уровня пероксидов липидов, воспалительные изменения в печени и кардиомиопатию[17]. Одновременно с этим в токсикологических обзорах подчеркивалось, что «общее отсутствие выраженных патологических эффектов» после употребления сильно или умеренно окисленных масел может быть следствием ограниченного всасывания ди- и полимеров и детоксикации пероксидов глутатионзависимыми ферментами, тогда как низкомолекулярные альдегиды легче абсорбируются и могут вызывать патологические эффекты в моделях на животных, хотя «маловероятно, чтобы люди потребляли количества, аналогичные» дозам, вызывающим такие эффекты в исследованиях на животных[15].
На уровне регулирования и оценки рисков для человека EFSA (2010) прямо заявило об отсутствии информации об уровнях окисления рыбьего жира, измеряемых по PV и анизидиновому числу, и о связанных с ними токсикологических эффектах у людей[8]. В этом контексте также цитируется вывод о том, что «сильно окисленные масла при пероральном приеме не проявляют острой токсичности для человека» (Esterbauer 1993), что согласуется с общей картиной: отсутствием надежных данных для определения порога безопасности на основе TOTOX, несмотря на существование биологически реактивных продуктов окисления и потенциальных долгосрочных эффектов[8, 15].
Является ли окисленная омега-3 провоспалительной или обладает ли она другими неблагоприятными свойствами
Механистически продукты окисления липидов могут стимулировать воспаление посредством окислительного стресса, который активирует путь NF-κB и увеличивает выработку провоспалительных цитокинов, а перекисное окисление мембран может изменять текучесть мембран, транспорт и клеточную сигнализацию, что часто описывается как важный патогенетический механизм[17, 26]. Соответственно, в моделях на животных вскармливание окисленными PUFAs ассоциировалось с воспалительными изменениями в печени, увеличением количества пероксидов липидов и рядом других патологических изменений[17].
В то же время оценка «провоспалительных» свойств окисленной омега-3 непосредственно на основе клинических исследований ограничена. С одной стороны, в обзорах приводится гипотеза о том, что повышение уровня окисления может ограничивать триглицерид- и холестеринснижающий эффект продуктов n-3, а длительное воздействие окисленных липидов может усиливать воспаление или даже повышать риск развития онкологических заболеваний; также отмечается, что в дозах, присутствующих в добавках, длительное воздействие продуктов окисления «вероятно, окажет пагубное влияние на воспаление, окислительный стресс и липидный обмен»[11, 13]. С другой стороны, цитируемые данные включают наблюдения о том, что окисленная EPA в модели клеточной культуры ингибировала воспалительный путь NF-κB, а окисленные метаболиты рыбьего жира и эндогенные пероксиды (включая производные EPA) могут оказывать благотворное воздействие in vivo, например, ингибируя NF-κB в макрофагах и снижая уровень MCP-1[10, 12].
Следовательно, на основании предоставленных цитат невозможно достоверно указать единый «уровень TOTOX, начиная с которого омега-3 становится провоспалительной» для человека, поскольку: (1) в обзорах указывается на нехватку клинических данных и оценки рисков при потреблении окисленных липидов, и (2) во многих клинических исследованиях окислительный статус масла, использованного в исследовании, вообще не приводится[10, 13]. Наиболее конкретные клинические данные, непосредственно сравнивающие различные уровни TOTOX (например, 45 по сравнению с 11), не показали существенных изменений в маркерах перекисного окисления, воспаления и окислительного стресса в краткосрочной перспективе (3–7 недель), что позволяет предположить, что при таких уровнях и времени воздействия провоспалительный эффект не фиксируется стандартными маркерами у здоровых лиц[12].
Клинические исследования на людях
В представленных материалах повторяется важное ограничение: «на сегодняшний день» в клинических исследованиях на людях часто не сообщается об окислительном статусе масла, использованного в испытаниях, что подрывает возможность связать результаты эффективности со окислительным качеством препарата[10]. Поэтому наиболее полезными для ответа на ваши вопросы являются исследования, в которых сообщаются показатели PV/AV/TOTOX для используемого в качестве вмешательства масла[12, 27].
Исследования с зарегистрированными параметрами окисления
В рандомизированном двойном слепом 7-недельном исследовании участники были распределены на три группы: принимавшие «высококачественный» рыбий жир (n=17), «окисленный» рыбий жир (n=18) и капсулы с высокоолеиновым подсолнечным маслом (HOSO) (n=19)[27]. Каждая группа ежедневно принимала по 16 капсул, содержащих в общей сложности 8 g/d соответствующего масла, при этом «значения общего окисления (2PV + AV)» составляли 11 (HOSO), 45 (окисленный FO) и 11 (высококачественный FO)[27]. Авторы также ссылаются на более ранние результаты, где «окисленный FO» характеризовался показателями PV=18 и AV=9, а «высококачественный FO» — PV=4 и AV=3, и в этом более раннем анализе потребление окисленного FO не повлияло на маркеры окислительного стресса, воспаления, перекисного окисления липидов или уровни окисленных LDL через 7 недель по сравнению с контрольной группой и группой, принимавшей высококачественное масло[27].
Отдельно цитируется «известное» RCT, в котором 83 человека были рандомизированы для употребления 8 g/d неароматизированного окисленного рыбьего жира (TOTOX = 45), неокисленного масла (TOTOX = 11) и высокоолеинового подсолнечного масла (TOTOX = 11) в течение 3–7 недель, при этом не было обнаружено существенных изменений в маркерах перекисного окисления липидов, системного воспаления или окислительного стресса[12]. Это исследование имеет решающее значение, поскольку оно напрямую связывает значение TOTOX со сравнением биологических эффектов (хотя и в краткосрочной перспективе)[12].
Кроме того, цитировалось исследование с участием здоровых добровольцев в возрасте 18–50 лет, в котором прием окисленного рыбьего жира, высококачественного масла или высокоолеинового масла ассоциировался со значимыми неблагоприятными изменениями в субфракциях липопротеинов через 7 недель (по сравнению с потреблением высококачественного масла), что указывает на потенциальные нежелательные метаболические эффекты по определенным конечным точкам, даже если маркеры воспаления не меняются однозначно[12].
Вопрос об исследовании 1993 года
Предоставленные цитаты не содержат прямого описания «исследования на людях 1993 года» авторов Wander и Du (а также определения «свежего» и «окисленного» масла в этом конкретном протоколе или параметров PV/AV/TOTOX для этих масел), поэтому невозможно достоверно ответить на часть вопросов об этом исследовании на основе данного материала без риска конфабуляции[10]. Однако в доступных фрагментах 1993 года Esterbauer (1993) фигурирует в качестве обзорного/токсикологического вывода о том, что сильно окисленные масла при пероральном приеме не проявляют острой токсичности для человека, что относится к острой безопасности, а не к спецификации качества TOTOX=26 или определению «свежего/окисленного» в исследовании вмешательства Wander/Du[15].
Если целью является реконструкция параметров «свежего» и «окисленного» масел из конкретного исследования 1993 года, наиболее близкими аналогами в представленных данных являются RCT, которые параметрзируют масло как «высококачественное» по сравнению с «окисленным» на основе PV/AV или TOTOX (например, PV=4 и AV=3 против PV=18 и AV=9; а также TOTOX=11 против 45), поскольку операциональные определения в них даны в явном виде[12, 27].
Выводы и практические последствия
Во-первых, TOTOX = 26 следует понимать в первую очередь как спецификацию качества (отраслевую и монографическую), основанную на комбинации PV и AV/p-AV, а не как клинически обоснованный порог безопасности; это согласуется как с наличием данного лимита в GOED, Codex и USP, так и с заявлением о том, что лимиты окисления не устанавливались «на основе безопасности», а также с мнением EFSA об отсутствии данных, связывающих уровни окисления с токсикологией для человека[1, 4–6, 8].
Во-вторых, окисление может быстро накапливаться в благоприятных условиях (кислород, свет, тепло), на что указывают данные об ускоренном окислении (например, PV ~+7 meq O_2/kg через 1 день и PV=126 через 30 дней при барботировании O_2 и воздействии света) и наблюдения за тем, что в реальном жизненном цикле продукта показатели PV/p-AV/TOTOX могут увеличиваться даже при неизменном содержании EPA/DHA[9, 20].
В-третьих, «предотвращение роста» на практике означает агрессивное замедление: ограничение доступа кислорода (заполнение азотом N_2/аргоном), уменьшение воздействия света, снижение температуры, правильный выбор и своевременность введения антиоксидантов (до начала окисления), а также предпочтение форм, ограничивающих контакт с воздухом (капсулы), при признании того, что абсолютная стабильность в реальных условиях недостижима[9, 17, 19].
В-четвертых, токсикология продуктов окисления указывает на существование реакционноспособных альдегидов с измеримой цитотоксичностью/генотоксичностью в клеточных моделях, но в то же время отсутствуют надежные данные для определения клинического «порога» в единицах PV/AV/TOTOX, и EFSA прямо указывает на пробел в доказательной базе в отношении соответствующих эффектов у человека[8, 15].
В-пятых, клинические данные о провоспалительном действии и общем вреде окисленных омега-3 неоднозначны: механизмы (NF-κB) и данные на животных предполагают потенциальные неблагоприятные эффекты, однако RCT с уровнями TOTOX 45 по сравнению с 11 не показало краткосрочных различий в маркерах воспаления, а в литературе также отмечаются контекстуальные, иногда «противовоспалительные» эффекты отдельных окисленных метаболитов EPA в экспериментальных моделях[10, 12, 17].
При необходимости я могу подготовить отдельное приложение в формате чек-листа для производителей/QA (критические точки процесса, упаковки и логистики), основанное исключительно на приведенных выше рекомендациях (N2/аргон, свет, температура, антиоксиданты, капсулированная или жидкая форма) и на типичных аналитических методах AOCS для определения PV и p-AV, чтобы перевести эти выводы в плоскость практического контроля качества[2, 17, 19].
