Executive Summary
TOTOX 26 in Omega-3 Supplements: Origin of the Limit, Oxidation Kinetics, Storage Conditions, Toxicology, and Clinical Data
TOTOX（ToToxと表記されることもある）は、オメガ-3オイルの酸化品質指標であり、 (または ) として算出される。ここで、PVは主に過酸化物/ヒドロ過酸化物（一次生成物）を反映し、AV/p-AVは二次酸化生成物（主にアルデヒド類）を反映する。これは「総」酸化度の総合的な測定基準となることを意図している[1–3]。
「26」という数値は、毒性学的に導き出された安全性の閾値ではなく、主に業界標準やモノグラフ（GOED、Codex CXS 329-2017、USP）における品質管理基準/規格として機能している。安全性に基づいて確立された魚油の酸化基準値は存在しないことが明確に強調されている[1, 4–6]。実務上、好条件（酸素、光、温度）のもとでは酸化が急速に進行する可能性があり、実生活において「絶対的な」安定性を達成することは不可能である。酸素、温度、光、および抗酸化物質を管理することによって、進行を大幅に遅らせることしかできない[7–9]。
毒性学的および臨床的データは一貫しておらず、現時点では、ヒトにおいて「オメガ-3が炎症促進性になる」具体的なTOTOXレベルを特定することはできない。同時に、酸化生成物が酸化ストレスおよびNF-κBを介して炎症経路を活性化する可能性があると疑う機序的根拠が存在し、サプリメント摂取量での酸化生成物への長期暴露は潜在的に好ましくないと評価されることもある[10, 11]。他方、引用されたRCTでは、TOTOXが約45のオイルと11のオイルを比較した結果、数週間にわたり脂質過酸化、炎症、および酸化ストレスのマーカーに有意な差は認められなかった[12]。
Origin of the TOTOX 26 Standard
TOTOX指数は、PVとAV/p-AVの加重和として定義され、最も一般的には または の形式をとる。これはUSPモノグラフおよびサプリメントの品質研究におけるTOTOX報告方法の記述に直接由来している[1, 2, 13]。測定実務を記述したレビュー文献では、TOTOXは酸敗の指標として用いられる「総酸化度」の測定基準であり、2つの試験を1つの数値に統合した構成概念という意味で「恣意的（arbitrary）」と呼ばれることもあると強調されている[3]。
提供された情報源において、この基準値は、急速に拡大する魚油市場において統一された規格が存在しなかったことへの対応として生じた品質基準に強く根ざしている。GOED（Global Organization for EPA and DHA Omega-3s）は、会員企業が満たすべきオメガ-3高含有オイルの基準値として、PV < 5 meq O_2/kg、p-AV < 20、およびTOTOX < 26という要件を記述している[4]。さらに、歴史的な資料によると、このモノグラフ（GOEDの前身であるCouncil for Responsible Nutritionのグループの取り組みに由来する）は「2002年以来の品質の業界定義」として機能しており、これが基準値の業界における起源と標準化の目的を説明している[14]。
並行して、ToTox/TOTOX = 26という基準値は、魚油に関するCodex Alimentarius規格（CXS 329-2017）に登場する。同規格では、ToToxパラメータ（「オイルの総酸化度」）は、一次および二次酸化生成物が同時に最大レベルで存在する状況を避けるために確立されたと述べられており、一連の基準値としてPV ≤ 5、AV ≤ 20、およびToTox ≤ 26を規定している[5]。同様に、USPの「Fish Oil containing Omega-3 Acids」モノグラフには、TOTOXは「26以下（not more than 26）」と明記され、その算出式が示されている[1]。
規制およびレビュー資料では同時に、食用魚油の酸化パラメータに関する情報が限定的であることが強調されており、EFSAは2010年の意見書において、酸化レベル（PVおよびアニシジン値）とそれに関連するヒトへの毒性効果に関するデータの不足を指摘している[8, 15]。この意味において、「26」は主に品質およびプロセス/鮮度管理のための規格であり、臨床的に導き出された安全性の閾値ではない[6, 8]。
以下の表は、引用文献に示された最も主要な基準値とその背景をまとめたものである。
How Quickly Oxidation Increases
オメガ-3の酸化は、脂肪酸組成、酸素や光への暴露、温度、抗酸化物質の含有量、水分や重金属の存在（触媒作用）などの要因に依存する、複雑かつ多因子的なプロセスである[8]。さらに、原料オイル中のごく微量の過酸化物や酸化条件への暴露であっても、n-3 PUFAの酸化速度に「劇的な」影響を与える可能性がある、加速的な連鎖反応として説明されている[7]。
大まかな目安（経験則）として、化学反応の速度は温度が10°C上昇するごとに2倍になり、これは脂質酸化についても引用されている[17, 18]。この経験則は実験データを置き換えるものではないが、なぜ高温での輸送や保管がPV/p-AV/TOTOXの上昇を大幅に加速させるのかを説明している[17, 19]。
確かな定量的データは、異なる「酸化条件」と異なるオイルを比較した加速酸化実験から得られている。標準的な蛍光灯照射下かつ室温において、酸素バブリング（99.5% O_2）を継続する条件下で30日間おいたところ、ホキ肝油ではわずか1日後にPVが約7 meq O_2/kg上昇し、30日後には126 meq O_2/kgに達し、30日後にはTOTOX = 295.7という極めて高い数値を伴った[20]。「暗所（放射なし）での50°Cにおける、ただし空気と接触した状態での「熱酸化」では、30日後のPVは36.3 ± 1.6 meq O_2/kg（ホキ）および43.2 ± 2.7 meq O_2/kg（アンチョビ）であり、ホキのTOTOXは117.4であった（O_2 ＋ 光の条件下よりも大幅に低い）[20]。
同一の実験において、酸化の進行に伴う「誘導時間」（酸化耐性が打破されるまでの時間）の短縮が報告されている。ホキ油では、開始時は約3時間であったが、30日後には1時間未満に低下し、抗酸化物質による「緩衝作用」が消費され反応生成物が蓄積するにつれて、酸化が自己増殖的に進行する傾向があることを示している[21]。
サプリメントにおいては、製品形態や消費者の行動との相互作用も重要である。カプセル剤、チュアブル製剤、およびシロップ剤（室温・暗所保存）を比較した研究では、保存期間終了時の最大値は、カプセル剤（PV最大7.62、TOTOX最大30.44）よりもシロップ剤（PV最大44.6 meq/kgオイル、TOTOX最大96.94）において有意に高く、チュアブル製剤は中間の値（PV最大26.14、TOTOX最大65.76）を示した[20]。いずれにせよ、ボトルの頻繁な開封、オイルと空気の接触表面積の拡大、および不適切な条件（室温、光）が、PVおよびp-AVの上昇、ひいてはTOTOXの上昇を加速させることがレビューにおいて強調されている[19]。
これを補完するのが「製品寿命」に関するデータである。賞味期限まで1年以内の5製品を対象とし、その1年後に再試験を行った観察では、EPAおよびDHA含有量に有意な変化はなかったが、PV、p-AV、およびTOTOXは上昇し、PVおよびTOTOXはそれぞれ5 meq O_2/kgおよび26の基準値に近づいた[9]。これは、EPA/DHA含有量が安定していても、保存中に酸化品質が低下する可能性があるという結論を裏付けている[9]。
市場レベルにおいて、サプリメントの品質研究では、かなりの割合 of 製品がGOED基準を超えていることが報告されている。38%がPV = 5 meq O_2/kgの基準を超え、無糖サプリメントの中では33%がTOTOX = 26の基準を超えていた[22]。同時に、別の市場調査（異なる基準値のセットを対象とする）では、96%が制限のより緩いTOTOX = 50の範囲内であったことが報告されており、「非適合」の割合が採用する規格に強く依存することを示している[23]。
What Would Have to Happen for TOTOX Not to Increase
実務上、実生活の条件下でTOTOXの上昇を「停止させる」（酸化の蓄積をゼロにする）ことは絶対に不可能であると断言されている。しかし、酸化を開始および維持する要因への暴露を減らすことにより、そのプロセスを大幅に遅らせることは可能である[9]。酸化の速度と程度は、酸素、光、温度、抗酸化物質、水分、および重金属に依存するため、効果的な戦略には、いくつかの「手段」に同時に働きかけることが求められる[8, 24]。
第一に、酸素との接触を最小限に抑えることが極めて重要である。技術的な推奨事項では、オイルを「脱気状態」で保存し、容器やカプセル内のヘッドスペースを窒素またはアルゴンで置換することが提案されており、これにより脂質相へのO_2の接触が減少する[17]。さらなる酸化を最小限に抑える分析プロトコルでは、「N_2ブランケット」下での保存や迅速な分析（抽出から30分以内）などの方法が含まれており、短時間の酸素暴露であっても結果や実際の変化に影響を及ぼす可能性があることを示している[7]。
第二に、光の制限と温度の低下には測定可能な重要性がある。オメガ-3サプリメントは冷暗所に保存し、液体オイルは冷蔵庫に保存することが推奨される。これは、温度上昇に伴う反応加速の法則、および酸化開始因子としての光の役割と一致している[17, 19]。また、ガラス製やプラスチック製のパッケージがUVを遮断し、他の素材が放射線に対する保護効果を高め得ることが示されている[17]。
第三に、抗酸化物質は、酸化が開始してペロキシルラジカルが生成される前に添加された場合に最も効果的に作用する。しかし、連鎖反応がすでに進行している、すでに酸化されたオイルに抗酸化物質を添加しても、得られる利点は限定的である[17]。トコフェロールが最も重要な抗酸化物質として挙げられ、抽出物（例：ローズマリー）、アスコルビン酸塩、およびクエン酸も使用される。後者は酸化を触媒する金属イオンをキレート化し、酸化品質の低下を効果的に遅らせることができる[17]。
第四に、オイルの酸素および光との接触に関しては、剤形が重要となる。ゼラチンカプセルはオイルを気密的に「封入」することにより、脂質と大気中の酸素との直接的な接触を制限し、光への暴露を減少させることがレビューで強調されており、多くの研究で、カプセル化された製品は液体形態よりも、特に長期保存後に低いPV/p-AV/TOTOXを示すことが観察されている[19]。他方で、管理された「暗所 ＋ 室温」条件下であっても、保存終了時にシロップ剤が最も高いPVおよびTOTOX値を示したことは、パッケージングおよび使用方法（開封、ヘッドスペース、時間）が酸化の軌跡に大きな影響を与えることを証明している[20]。
Toxicology of Oxidation Products
オメガ-3オイルの酸化は、一次および二次生成物の混合物の形成をもたらす。引用された情報源では、酸化が進行するにつれて未酸化の脂肪酸の量が減少し、二次生成物（アルデヒドやケトンを含む）と過酸化物（「液体過酸化物」）の複雑な混合物が現れると説明されている[24]。また、一次ヒドロ過酸化物は、高い反応性と細胞毒性を持つ4-hydroxy-2-alkenalsを含む二次生成物へと分解される可能性があり、脂質過酸化物は4-hydroxyhexenal（HHE）やマロンジアルデヒド（MDA）などのアルデヒド類へと劣化する可能性があることが強調されている[10, 25]。
毒性学的には、α,β-不飽和アルデヒド（例：HNE/HOE）およびその他の低分子量アルデヒドが特に重要である。レビューでは、このクラスの化合物の中でHNEおよびHOEが最も毒性が高く、HHEは最も毒性が低い部類に入ることが指摘されている[15]。HNEについては、0.1 μM超の遺伝毒性閾値、および1–20 μMの範囲でのDNAおよびタンパク質合成の部分的阻害が引用されており、アクロレインについては、哺乳類細胞に対するLD50 = 20 μM、および約1 μMでのコロニー形成能の有意な低下が示されている[15]。これらの数値は、選択された酸化生成物が細胞モデルにおいて低濃度で生物学的に活性を持ち得ることを示しているが、これが食事による摂取量や実際の暴露量に自動的に翻訳されるわけではない[15]。
動物モデルでは、酸化されたPUFAの給餌が、成長抑制、腸管への刺激、肝臓および腎臓の肥大、溶血性貧血、ビタミンEの減少、脂質過酸化物の上昇、肝臓における炎症性変化、および心筋症を含む有害作用を誘発し得ることが示唆されている[17]。同時に、毒性学のレビューでは、高度にまたは軽度に酸化されたオイルを摂取した後の「肉眼的な病理学的効果の全般的な欠如」は、二量体および多量体の吸収制限、ならびにグルタチオン依存性酵素による過酸化物の解毒に起因する可能性があることが強調されている。一方で、低分子量アルデヒドはより容易に吸収され、動物モデルにおいて病理学的効果を引き起こす可能性があるものの、ヒトが動物研究でそのような効果を引き起こす用量と「同様の量を摂取する可能性は低い」とされている[15]。
規制およびヒトのリスク評価レベルにおいて、EFSA（2010年）は、PVおよびアニシジン値によって測定される魚油の酸化レベル、およびそれに関連するヒトへの毒性効果に関する情報の不足を明言している[8]。これに関連して、「経口投与された高度に酸化されたオイルは、ヒトに対して急性毒性を示さない」（Esterbauer 1993）という結論も引用されている。これは、生物学的に反応性の高い酸化生成物や潜在的な長期影響が存在する一方で、TOTOXに基づく安全閾値を決定するための十分なデータが不足しているという全体像と一致している[8, 15]。
Is Oxidized Omega-3 Pro-inflammatory or Does It Have Other Adverse Properties
機序的には、脂質酸化生成物は酸化ストレスを介して炎症を促進する可能性があり、これがNF-κB経路を活性化して炎症性サイトカインの産生を増加させ、膜の過酸化が膜の流動性、輸送、および細胞シグナル伝達を変化させる可能性があり、これはしばしば重要な病原性メカニズムとして説明されている[17, 26]。したがって、動物モデルにおいて、酸化されたPUFA of 給餌は、肝臓における炎症性変化、脂質過酸化物の上昇、およびその他の一連の病理学的変化と関連していた[17]。
同時に、臨床研究に直接基づく、酸化されたオメガ-3の「炎症促進」特性の評価は限定的である。一方では、レビューにおいて、酸化レベルの上昇がn-3製品のトリグリセリドおよびコレステロール低下作用を制限する可能性があるという仮説、酸化脂質への長期暴露が炎症やがんリスクさえも増加させる可能性があるという仮説、また、サプリメントに含まれる用量において、酸化生成物への長期暴露は「炎症、酸化ストレス、および脂質代謝に有害な影響を及ぼす可能性が高い」という指摘が引用されている[11, 13]。他方では、引用されたデータの中に、組織培養モデルにおいて酸化されたEPAが炎症性NF-κB経路を阻害したという観察や、魚油の酸化代謝物および内因性過酸化物（EPA誘導体を含む）がin vivoで有益な効果（マクロファージにおけるNF-κBの阻害やMCP-1の減少など）を発揮し得ることが含まれている[10, 12]。
したがって、提供された引用文献に基づいて、ヒトにおいて「このTOTOXレベルからオメガ-3が炎症促進性になる」という単一の基準を確実に示すことは不可能である。その理由は、(1) レビューが酸化脂質の摂取に関する臨床データおよび危害評価の不足を指摘していること、(2) 多くの臨床試験において、試験で使用されたオイルの酸化状態が全く報告されていないこと、にある[10, 13]。異なるTOTOXレベル（例：45 vs. 11）を直接比較した最も具体的な臨床データでは、短期間（3–7週間）において過酸化、炎症、および酸化ストレスのマーカーに有意な変化は示されなかった。このことは、そのようなレベルおよび暴露時間においては、健康な被験者における標準的なマーカーでは炎症促進作用を容易に捉えられないことを示唆している[12]。
Clinical Studies in Humans
提供された資料において、ある重要な限界が繰り返し述べられている。すなわち「現在までに」、ヒトの臨床研究では試験で使用されたオイルの酸化状態が報告されていないことが多く、このことが有効性の結果と製剤の酸化品質を関連付ける能力を損なっている[10]。したがって、ご質問に対して最も有用な研究は、介入オイルのPV/AV/TOTOXを報告しているものである[12, 27]。
Studies with Reported Oxidation Parameters
ランダム化二重盲検7週間試験において、参加者は「高品質」魚油（n=17）、「酸化」魚油（n=18）、および高オレイン酸ひまわり油（HOSO）カプセル（n=19）の3つのグループに割り付けられた[27]。各グループは毎日、それぞれのオイルを合計8 g/d含む16カプセルを摂取し、「総酸化値（2PV + AV）」は、HOSOが11、酸化FOが45、高品質FOが11であった[27]。著者らはまた、「酸化FO」がPV=18およびAV=9、「高品質FO」がPV=4およびAV=3という特徴を有していた以前の結果にも言及しており、この以前の分析では、酸化FOの摂取は対照オイルおよび高品質オイルと比較して、7週間後に酸化ストレス、炎症、脂質過酸化、または酸化LDLレベルのマーカーに影響を与えなかった[27]。
別途引用されている「有名な」RCTでは、83名の被験者が、味付けなしの酸化魚油（TOTOX = 45）、未酸化オイル（TOTOX = 11）、および高オレイン酸ひまわり油（TOTOX = 11）を8 g/d、3–7週間摂取するようランダムに割り付けられたが、脂質過酸化、全身性炎症、または酸化ストレスのマーカーに有意な変化は見られなかった[12]。この研究は、TOTOX値と生物学的効果の比較を（依然として短い時間軸ではあるものの）直接結びつけているため、極めて重要である[12]。
さらに、18–50歳の健康な被験者を対象とした試験が引用されており、酸化魚油、高品質オイル、または高オレイン酸オイルへの暴露は、7週間後にリポタンパク質サブフラクションにおいて有意かつ有害な変化（高品質オイルの摂取との比較において）と関連していた。これは、炎症マーカーが明白に変化しない場合であっても、特定の評価項目において潜在的な有害代謝効果があることを示唆している[12]。
Question about the 1993 Study
提供された引用文献には、WanderおよびDuによる「1993年のヒトにおける研究」の直接的な記述は含まれておらず、またその具体的なプロトコルにおける「新鮮な」オイル対「酸化された」オイルの定義や、これらのオイルのPV/AV/TOTOXパラメータも記載されていない。したがって、虚偽の記載（confabulation）を避けるため、この資料に基づいてその研究に関する質問の一部に確実に回答することは不可能である[10]。しかし、1993年の利用可能な断片の中に登場するEsterbauer（1993）は、経口投与された高度に酸化されたオイルはヒトに対して急性毒性を示さないというレビュー/毒性学的結論を示している。これは急性の安全性に関するものであり、TOTOX=26の品質規格や、Wander/Duの介入研究における「新鮮/酸化」の定義に関するものではない[15]。
特定の1993年の研究から「新鮮な状態と酸化された状態」のパラメータを再構築することが目的である場合、提供されたデータの中で最も近い代替となるのは、オイルをPV/AVまたはTOTOXによって「高品質」対「酸化」としてパラメータ化しているRCTである（例：PV=4およびAV=3 vs. PV=18およびAV=9、ならびにTOTOX=11 vs. 45）。これらの試験では操作的定義が明確であるためである[12, 27]。
Conclusions and Implications
第一に、TOTOX = 26は、臨床的に導き出された安全性の閾値ではなく、PVとAV/p-AVの組み合わせに基づく品質規格（業界規格およびモノグラフ規格）として主に理解されるべきである。これは、この基準値がGOED、Codex、およびUSPに存在すること、また「安全性に基づいて」確立された酸化基準値は存在しないという宣言、さらには酸化レベルとヒトの毒性学を結びつけるデータの不足に関するEFSAの意見書の両方と一致している[1, 4–6, 8]。
第二に、加速酸化データ（例：O_2バブリングおよび光照射下において、1日後にPVが約+7 meq O_2/kg上昇、30日後にPV=126に達する）や、製品の実際のライフサイクルにおいて、EPA/DHA含有量が変化しない場合であってもPV/p-AV/TOTOXが上昇し得るという観察が示すように、好条件（酸素、光、熱）下では酸化が急速に蓄積する可能性がある[9, 20]。
第三に、実務上「進行を防ぐ」とは、実生活の条件下で絶対的な安定性を達成することは不可能であることを認めつつも、酸素の制限（N_2/アルゴン置換）、光の減少、温度の低下、抗酸化物質の添加の適切な選択とタイミング（酸化開始前）、および空気との接触を制限する剤形（カプセル）の優先など、プロセスの進行を積極的に遅らせることを意味する[9, 17, 19]。
第四に、酸化生成物の毒性学は、細胞モデルにおいて測定可能な細胞毒性/遺伝毒性を有する反応性アルデヒドの存在を示している。しかし同時に、PV/AV/TOTOX単位での臨床的な「閾値」を決定するための十分なデータが不足しており、EFSAは関連するヒトへの影響に関するエビデンスのギャップを明示的に指摘している[8, 15]。
第五に、酸化されたオメガ-3の炎症促進性および全体的な有害性に関する臨床データはまちまちである。機序（NF-κB）および動物データは潜在的な有害作用を示唆しているが、TOTOX 45と11を比較したRCTでは、短期間の炎症マーカーに有意な差は示されず、また文献は、実験モデルにおいて、選択された酸化EPA代謝物が文脈に応じて時に「抗炎症」効果を示すことも指摘している[10, 12, 17]。
ご要望に応じて、上記の引用された推奨事項（N2/アルゴン、光、温度、抗酸化物質、カプセル剤対液体製剤）およびPVとp-AVに関する典型的なAOCS分析法のみに基づき、製造業者/QA向けの個別のアネックス「チェックリスト」（重要プロセス、包装、および物流のポイント）を作成し、これらの知見を実務的な品質管理に反映させることが可能です[2, 17, 19]。
