Sažetak
Bornavirusi (npr. Borna disease virus, BDV; Borna disease virus 1, BoDV-1) su nesegmentirani, negativni jednolančani RNA virusi čija je najistaknutija značajka među životinjskim nesegmentiranim negativnim RNA (NNS-RNA) virusima to što se transkripcija i replikacija genoma odvijaju u jezgri stanice domaćina, a ne pretežito u citoplazmi[1–3]. Molekularne studije BDV-a definirale su kompaktan genom od ~8,9–9 kb s višestrukim otvorenim okvirima čitanja organiziranim u mali broj transkripcijskih jedinica i okruženim ekstrakistronskim terminalnim sekvencama koje funkcioniraju kao promotori i regulatorne granice za sintezu virusne RNA[4–8]. Ekspresija gena je složena i uključuje proizvodnju monocistronskih i policistronskih poly(A)+ RNA, učestalo pročitavanje (readthrough) na mjestima terminacije te korištenje splicinga za ekspresiju ključnih proizvoda, uključujući polimerazu (L) u određenim kontekstima transkripata[4–6, 9, 10]. Sustavi funkcionalne rekonstitucije i minigenoma mapirali su zahtjeve cis-djelujućih promotora na 3′ genomskom kraju i pokazali da N i P enkapsidiraju predloške koje prepoznaje polimerazni kompleks L/P radi generiranja replikacijskih i transkripcijskih proizvoda[11, 12]. Nuklearna organizacija i transport dodatno oblikuju program replikacije, pri čemu virusne „mrlje transkripata” (vSPOTs) i CRM1-ovisan izvoz nukleoproteina pridonose dinamici RNP-a i kompartmentalizaciji poly(A)+ naspram poly(A)− virusnih RNA[3, 13–15].
Ključne riječi
- Bornavirus[1]
- Borna disease virus[4]
- nesegmentirani negativni RNA virus[4]
- nuklearna replikacija[2]
- transkripcijsko pročitavanje (readthrough)[5]
- vSPOTs[3]
- minigenom[11]
- CRM1 izvoz[15]
- fosfoprotein P[15]
- RNA-ovisna RNA polimeraza L[16]
Uvod
Bornavirusi su NNS-RNA virusi čije se konsenzusne sekvence promotora i početka gena podudaraju s obrascima opaženim u obiteljima reda Mononegavirales, što ukazuje na zajedničku logiku transkripcije negativnog lanca na razini cis-djelujućih inicijacijskih elemenata[4, 17]. Središnja mehanistička razlika je u tome što se, dok se većina mononegavirusa uglavnom replicira u citoplazmi, bornavirusi repliciraju u jezgri, gdje uspostavljaju specijalizirana nuklearna mjesta za sintezu virusne RNA[1, 3]. Eksperimentalni dokazi specifično podupiru da se replikacija i transkripcija BDV-a odvija u jezgrama inficiranih stanica i da su povezane s infektivnim ribonukleoproteinskim kompleksima (BDV-RNPs), naglašavajući da se sinteza bornavirusne RNA izvršava u kontekstu nuklearnih RNP-ova[4, 13]. Nuklearna lokalizacija dodatno je potvrđena frakcioniranjem stanica koje pokazuje da je većina novosintetizirane BDV RNA genomske polarnosti poly(A)− i da se nalazi uglavnom u nuklearnoj frakciji, što je u skladu s nuklearnom replikacijom genomske RNA[13].
Organizacija genoma
Sekvenciranje i mapiranje genoma BDV-a identificiralo je linearni genom od ~8,9 kb s predviđenim glavnim otvorenim okvirima čitanja duž genoma, okruženim nekodirajućim sekvencama na oba kraja[4, 5]. U jednom izvješću, predviđeno je pet glavnih ORF-ova (I–V) u sekvenci genoma BDV-a od 8.903 nt, dok je drugi opis genoma BDV-a (8.910 nt) slično zabilježio antisense informacije za pet glavnih ORF-ova okruženih s 53 nt nekodirajuće sekvence na 3′ kraju i 91 nt na 5′ kraju[4, 5]. Uz okvir s pet ORF-ova, mapiranje na razini antigenoma opisalo je tri transkripcijske jedinice i šest ORF-ova, a pregledni sažeci također opisuju BDV kao virus koji kodira šest ORF-ova u tri transkripcijske jedinice uokvirene komplementarnim krajevima nalik na druge NNS RNA viruse[6, 7].
Najveća kodirajuća regija (ORF V) kodira predviđeni protein od ~170 kDa s jakom homologijom s obitelji L-proteina polimeraza NNS-RNA virusa, postavljajući virusnu RNA-ovisnu RNA polimerazu na 5′-proksimalni kraj skupa gena u kanonskom rasporedu negativnog lanca[4]. Analiza konzerviranih sekvenci identificirala je najvišu homologiju u pretpostavljenoj katalitičkoj domeni s invarijantnim i konzerviranim ostacima grupiranim u četiri visoko konzervirana motiva (A–D), što je u skladu s konzerviranim enzimskim ograničenjima funkcije polimeraze među NNS-RNA virusima[18]. Zabilježeno je da infektivni BDV-RNPs sadrže samo jednu vrstu BDV RNA, poly(A)− RNA negativnog polariteta od 9 kb, što podupire da je poly(A)− RNA duljine genoma enkapsidirana vrsta predloška u infektivnim RNP-ovima[13].
Genomi bornavirusa također nose regulatorne granične regije tipične za NNS-RNA viruse, s ORF-ovima okruženim netranslatiranim graničnim sekvencama koje uključuju signale za inicijaciju i zaustavljanje transkripcije[8]. Terminalne sekvence mogu se upariti u strukturu sličnu drški tave (panhandle), a kod BDV-a poravnanje genomskih krajeva omogućilo je stvaranje terminalne drške tave s prva 3 neuparena nukleotida, povezujući terminalnu komplementarnost s arhitekturom promotora bez zahtjeva za savršenim dupleksom[5]. Važno je napomenuti da su analize genomskih krajeva BDV-a izvijestile i o nedostatku savršene terminalne komplementarnosti i o povećanoj heterogenosti terminalnih sekvenci tijekom dugotrajne perzistencije, što ukazuje na to da su cis-djelujuće terminalne regije varijabilne, ali funkcionalno tolerirane kroz različita stanja infekcije[11].
Kako bi se sažeto prikazala arhitektura genoma i ekspresije gena opisana u ovim izvorima, donja tablica uspoređuje nekoliko često citiranih organizacijskih značajki.
Transkripcija i ekspresija gena
Ekspresija gena bornavirusa kod BDV-a uključuje višestruke poliadenilirane subgenomske RNA komplementarne genomu negativnog polariteta, pri čemu je jedna studija identificirala devet vrsta poliadeniliranih subgenomskih RNA, uključujući šest policistronskih poly(A)+ RNA i monocistronske mRNA koje odgovaraju ORF-ovima I, II i IV[4]. U istoj analizi, monocistronske poly(A)+ RNA za ORF-ove III i V nisu otkrivene, što ukazuje na to da ekspresijom nekih kodirajućih regija u BDV-u ne dominiraju jednostavne monocistronske poruke[4]. Northern analize također su pokazale da BDV transkribira i mono- i policistronske RNA te koristi signale terminacije/poliadenilacije slične onima kod drugih negativnih RNA virusa, što je u skladu s transkripcijskim programom „stop–start” koji unatoč tome rezultira učestalim kontinuitetom transkripta izvan mjesta terminacije[5].
Terminacija i poliadenilacija uključuju diskretna mjesta i prepoznatljiv signal. Eksperimenti Northern hibridizacije poduprli su korištenje specifičnih mjesta terminacije (T2, T3, T5 i T7) i identificirali konsenzusnu sekvencu signala terminacije/poliadenilacije, pružajući molekularne orijentire za granice transkripata i sklonost pročitavanju (readthrough)[5]. BDV je također značajan po visokoj učestalosti pročitavanja transkripata u usporedbi s drugim negativnim RNA virusima, što implicira da je učinkovitost terminacije sustavno podešena i može biti mehanistički bitna[5]. Doista, pročitavanje T3 neophodno je za ekspresiju p190 (polimerazni protein), izravno povezujući supresiju terminacije s dostupnošću polimeraze, a time i s kapacitetom za replikaciju i transkripciju[9].
BDV mRNA molekule imaju kapu (cap) i poliadenilirane su, što pokazuje da je sazrijevanje mRNA u skladu s proizvodnjom RNA sposobnih za translaciju unatoč nuklearnoj replikacijskoj niši[19]. Dodatna kodirajuća raznolikost generira se splicingom, jer RNA od 2,8 kb i 7,1 kb sadrže dva introna koji se diferencijalno prekrajaju kako bi nastale RNA koje kodiraju više proizvoda, uključujući G i proteine povezane s polimerazom, a zasebni navodi ukazuju na to da ekspresija L zahtijeva splicing i supresiju terminacije[6, 10]. Na razini inicijacije i strukture promotora, čini se da savršena terminalna komplementarnost nije potrebna za visoku aktivnost promotora, a povećana terminalna komplementarnost nije potaknula replikaciju naspram transkripcije od strane BDV polimeraze, što ukazuje na to da ravnoteža replikacije i transkripcije nije samo funkcija snage terminalnog uparivanja baza[11].
Pregled ciklusa replikacije
Replikacija bornavirusa definirana je nuklearnom sintezom RNA i nuklearnom organizacijom virusnih RNP-ova. Višestruki izvori pružaju dokaze da se replikacija i transkripcija BDV-a odvijaju u jezgri u povezanosti s infektivnim BDV-RNP-ovima, utvrđujući da je funkcionalni predložak za sintezu RNA RNP kompleks koji djeluje u nuklearnom okruženju[4, 13]. Eksperimenti kvantitativnog frakcioniranja i obilježavanja dodatno su pokazali da je većina novosintetizirane RNA BDV genomske polarnosti poly(A)− i nuklearna, što podupire zaključak da se replikacija genoma odvija u jezgri inficiranih stanica[13].
Pojavljuje se dosljedan obrazac kompartmentalizacije za različite klase virusne RNA. BDV poly(A)− RNA od 9 kb uglavnom je nuklearna, dok se novosintetizirane poly(A)+ RNA transportiraju u citoplazmatski odjeljak, što ukazuje na to da su izvoz mRNA i zadržavanje genoma razdvojeni preko nuklearne ovojnice[13, 14]. Pokazalo se da je transport BDV mRNA ovisan o energiji, što implicira aktivni izvoz umjesto pasivne difuzije kao ključnu kontrolnu točku za ekspresiju gena u infekciji nuklearnim bornavirusom[20].
Bornavirusi također sastavljaju nuklearne virusne tvornice opisane kao „virusne mrlje transkripata” (vSPOTs), pružajući strukturni kontekst za koncentriranu transkripciju/replikaciju i potencijalno koordiniranu obradu RNA u jezgri[1]. Kod BoDV-1, vSPOTs formirani tekuće-tekućim faznim razdvajanjem potaknutim P proteinom prisutni su u jezgri i usko komuniciraju s kromatinom, uključujući pristajanje na dvolančane lomove DNA neurona, povezujući mjesta replikacije sa specifičnim nuklearnim podstrukturama[3]. U skladu sa središnjom ulogom RNP-ova, zabilježeno je da kompleksi BDV-RNP koji sadrže samo vrstu RNA od 9 kb posjeduju polimeraznu aktivnost potrebnu za transkripciju i nose genetske informacije potrebne za usmjeravanje sinteze BDV makromolekula i proizvodnju infektivnih BDV čestica, povezujući RNP-ove duljine genoma s nizvodnim koracima u životnom ciklusu virusa[21].
RNP i polimerazni sustav
RNA BDV-a duljine genoma pakirana je u RNP komplekse koji sadrže N i virusni RNA-ovisni kompleks RNA polimeraze, definirajući temeljni sustav kao nukleokapsidni predložak vezan za polimerazni kompleks[15]. RdRp kompleks sastoji se od P i L te je odgovoran za replikaciju i transkripciju virusnog genoma, utvrđujući L kao katalitičku podjedinicu i P kao bitan kofaktor polimeraze u BDV-u[15]. Strukturni i funkcionalni opisi dodatno definiraju L kao RdRp od ~192 kDa koji čini jezgru replikacijskog kompleksa, izvodeći transkripciju i replikaciju za proizvodnju virusne mRNA i novih kopija genoma, te se udružuje s P za učinkovitu sintezu RNA[16].
Svojstva proteinske interakcije P proteina pružaju mehanistički uvid u funkciju polimeraze. P se samoudružuje u oligomere putem središnje oligomerizacijske domene i premošćuje RdRp i nukleokapsid, a također djeluje kao chaperon za N kako bi ga održao u obliku bez RNA potrebnom za replikaciju, podržavajući model u kojem P koordinira i novačenje enzima i spremnost predloška[3]. Dosljedno tome, eksperimentalno narušavanje oligomerizacije P proteina u testu minireplikona ispitalo je mogu li mutanti P defektni u oligomerizaciji rekonstituirati funkcionalne polimerazne komplekse, a nijedan od mutanata P nije podržao ekspresiju reportera, što ukazuje na to da je oligomerizacija P potrebna za aktivnost polimeraze pod tim uvjetima[22]. Osim toga, kofaktorska aktivnost P za BDV RdRp negativno je regulirana fosforilacijom, pružajući eksplicitnu post-translacijsku regulatornu polugu za funkciju polimeraze[15].
Izoforme nukleoproteina bornavirusa također povezuju funkciju proteina s unutarstaničnom lokalizacijom. Eksperimenti koji su eksprimirali p40 i p38 pokazali su da je p40 prvenstveno nuklearan, dok je p38 prvenstveno citoplazmatski, no oba vežu bornavirusni fosfoprotein P, sugerirajući da lokalizacija ovisna o izoformi povezana s vezanjem P može modulirati mjesto gdje se odvija sastavljanje i/ili funkcija RNP-a[9]. U skladu s ulogom P u nuklearnom usmjeravanju, P sadrži snažan bipartitni signal nuklearne lokalizacije (NLS) na svom amino-terminusu i dodatne slabije NLS motive, što podupire nuklearni uvoz kompleksa koji sadrže polimerazu kao mehanistički preduvjet za nuklearnu sintezu RNA[9].
Konačno, akcesorni protein X može izravno modulirati sintezu RNA naniže u rekonstituiranim sustavima. Kada su kompleksi polimeraze BDV-a rekonstituirani u stanicama koje eksprimiraju protein X, nije otkrivena minigenomska RNA plus-lanca, što sugerira da X inhibira i virusnu transkripciju i replikaciju u tom kontekstu testa[23]. Ova opažanja zajedno podupiru model sustava u kojem L i P čine katalitičku jezgru, oligomerizacija i fosforilacija P reguliraju kompetentnost polimeraze, a akcesorni faktori kao što je X mogu potisnuti učinak polimeraze pod definiranim uvjetima[15, 23].
Nuklearni transport
Bornavirusi povezuju nuklearnu replikaciju s reguliranim nukleocitoplazmatskim transportom komponenti RNP-a i vrsta RNA. Izravni dokazi ukazuju na to da se replikacija i transkripcija BDV-a odvijaju u jezgrama u kojima su prisutni infektivni BDV RNP-ovi, a frakcioniranje ukazuje na to da je novosintetizirana RNA genomske polarnosti snažno obogaćena u nuklearnoj frakciji, pružajući funkcionalni poticaj putovima nuklearnog uvoza i izvoza za koordinaciju životnog ciklusa[13, 21]. Testovi transporta RNA ukazuju na to da se novosintetizirane BDV poly(A)+ RNA učinkovito transportiraju u citoplazmatski odjeljak dok 9-kb genomska RNA ostaje uglavnom nuklearna, pokazujući ponašanje izvoza specifično za klasu RNA[14]. Štoviše, transport mRNA ovisi o energiji, s zanemarivim izvozom u odsutnosti ATP-a, što podupire aktivne mehanizme izvoza virusnih mRNA ovisne o faktorima domaćina[20].
Za transport proteina, CRM1-ovisan izvoz impliciran je za nukleoprotein. Nuklearni izvoz N odvija se putem CRM1-ovisnog puta u skladu s NES-om, a zasebna izjava slično izvještava da se nuklearni izvoz BoDV-N događa putem CRM1-ovisnog puta, što ukazuje na konzervaciju ove rute izvoza unutar bornavirusa[15, 24]. Širi pregledi dalje navode da nekoliko proteina BDV-a (uključujući nukleoprotein, fosfoprotein, X i L) pridonosi nukleocitoplazmatskom transportu BDV RNP-a, te da je smjerna kontrola vjerojatno određena omjerima i interakcijama između NLS i NES elemenata u RNP-u, uokvirujući transport kao emergentno svojstvo konkurentnih signala lokalizacije, a ne kao jedan determinant[25].
Formiranje nuklearne virusne tvornice pruža dodatnu organizacijsku razinu relevantnu za transport. Bornavirusi sastavljaju vSPOTs u jezgri, a vSPOTs BoDV-1 formirani su tekuće-tekućim faznim razdvajanjem potaknutim P proteinom i usko komuniciraju s kromatinom, što može ograničiti difuziju i potencijalno usmjeriti pozicioniranje mjesta transkripcije/replikacije u odnosu na nuklearne orijentire domaćina[1, 3].
Reverznu genetika i elementi promotora
Cis-djelujući regulatorni signali bornavirusa koncentrirani su u netranslatiranim graničnim i terminalnim regijama. U BDV-u, ORF-ovi su okruženi netranslatiranim graničnim sekvencama koje sadrže regulatorne signale za inicijaciju i zaustavljanje transkripcije, što je u skladu s arhitekturom nalik Mononegavirales gdje signali za početak i kraj gena vode ponašanje polimeraze duž genoma[8]. Izvedena BDV početna konsenzusna sekvenca (UNCNNNUUNN) identična je onoj dobivenoj usporedbom NNS-RNA virusa kroz više obitelji reda Mononegavirales, što podupire konzervaciju motiva inicijacije koji koristi polimerazni sustav[4, 17]. Signali terminacije/poliadenilacije uključuju konzervirani AUUUUU heksamer na 5′ kraju svakog signala terminacije/poliadenilacije praćen s GG (ili CG u ORF II), dok se potencijalni signali nisu mogli identificirati za ORF III u jednoj analizi, što ukazuje i na konzervaciju i na praznine u mogućnosti detekcije motiva preko granica gena[4].
Pristupi reverzne genetike i minigenoma izravno su testirali ove regulatorne elemente. Sustav RNA polimeraze I/polimeraze II uspostavljen je za unutarstaničnu rekonstituciju replikacije i transkripcije BDV RNA, omogućujući kontroliranu disekciju cis- i trans-djelujućih zahtjeva[11]. U ovom sustavu, analog BDV RNA (minigenom) sintetizira stanična RNA polimeraza I i sadrži BDV 5′ i 3′ netranslatirane cis-djelujuće sekvence potrebne za sintezu RNA posredovanu BDV polimerazom, povezujući terminalne regije s funkcijom promotora u stanicama[11]. Enkapsidacija minigenomske RNA dobivene polimerazom I pomoću BDV N i P isporučenih plazmidom stvara predložak koji prepoznaje rekonstituirana BDV polimeraza kako bi usmjerila sintezu antiminigenomske RNA pune duljine (replikacija) i subgenomske mRNA koja kodira reporterski gen, eksperimentalno pokazujući da je enkapsidacija N i P dovoljna da RNA postane kompetentna za prepoznavanje od strane polimeraze i sintezu RNA s dvostrukim ishodom[11].
Mapiranje promotora dodatno usavršava cis-djelujući model. Nizvodne sekvence (nukleotidi 25 do 33) bile su potrebne za optimalnu aktivnost promotora, a delecija nukleotida 34 do 35 ukinula je aktivnost reportera u ovom kontekstu, identificirajući kratke, pozicijski specifične zahtjeve proksimalne promotoru u 3′ genomskoj regiji promotora[12]. Zajedno, ovi podaci podupiru arhitekturu promotora u kojoj kompaktne terminalne sekvence i obližnji nizvodni elementi upravljaju inicijacijom i produktivnom replikacijom/transkripcijom u rekonstituiranom polimeraznom sustavu[11, 12].
Mehanizmi perzistencije
Molekularna perzistencija bornavirusa povezana je s dinamikom krajeva genoma, nuklearnom replikacijom i specijaliziranom nuklearnom organizacijom. Proces „ponovnog poravnanja i elongacije” (realign-and-elongation) obnavlja 3′ terminale v- i cRNA molekula s unutarnjih predložaka tijekom svakog kruga replikacije i može se dogoditi samo ako su terminali potpuni, pružajući eksplicitan mehanistički korak koji djeluje kao kontrolna točka kvalitete integriteta genoma[26]. Ovaj proces pruža integriranu kontrolu kvalitete koja potiskuje replikaciju RNA molekula s terminalnim delecijama, povezujući logiku popravka krajeva s odabirom protiv defektnih replikacijskih intermedijera[26]. Paralelno, analize genomskih krajeva tijekom dugotrajne perzistentne infekcije izvijestile su o višem stupnju terminalne heterogenosti u RNA iz perzistentno inficiranih stanica u usporedbi s akutnim vremenskim točkama, što ukazuje na to da je perzistencija popraćena pomacima u distribuciji varijanti krajeva genoma[11].
Perzistencija je također povezana sa stabilnim nuklearnim kontekstom za RNP-ove. Bornavirusi su opisani kao jedinstveni među poznatim životinjskim NNS RNA virusima koji se repliciraju i transkribiraju u jezgri, što osigurava stanični kompartmentalni okvir za dugotrajnu necitolitičku sintezu RNA i nuklearnu obradu krajeva genoma[2]. Uz to, BoDV-1 konstruira svoje vRNP-ove koristeći kromatin domaćina kao skelu, svojstvo koje može mehanistički podržati perzistenciju u jezgri stabilizacijom pozicioniranja vRNP-a u odnosu na kromatin[27].
Modulacija odgovora domaćina također je eksperimentalno povezana sa stanjima infekcije. BDV-inficirane stanice lučile su manje SEAP-a nego kontrolne (mock) stanice nakon aktivacije Pam3CSK4, što sugerira da BDV-inficirane stanice aktivno potiskuju NF-κB signalizaciju, što pruža korelat na molekularnoj razini za promijenjenu urođenu signalizaciju tijekom perzistentne infekcije[28].
Otvorena pitanja
Nekoliko molekularnih pitanja ostaje otvoreno ili su spremna za ciljane eksperimente na temelju gore sažetih mehanističkih nalaza.
- Koji sekvencijalni i strukturni determinanti kontroliraju učinkovitost terminacije BDV-a i visoku učestalost pročitavanja (readthrough) transkripata, osobito na T3 gdje je pročitavanje bitno za ekspresiju polimeraze[5, 9]?
- Kako se alternativni splicing događaji u RNA od 2,8 kb i 7,1 kb povezuju s korištenjem transkripcijskih granica kako bi se dobile točne stehiometrije G i proizvoda povezanih s polimerazom, uključujući slučajeve u kojima ekspresija L zahtijeva splicing i supresiju terminacije[6, 10]?
- Kakav je kvantitativni odnos između terminalne heterogenosti opažene tijekom perzistencije i aktivnosti promotora, s obzirom na to da savršena terminalna komplementarnost nije potrebna za visoku aktivnost promotora i da se terminali diverzificiraju tijekom dugotrajne infekcije[11]?
- Kako je kontrolni korak kvalitete „ponovnog poravnanja i elongacije” koordiniran s nuklearnom RNP organizacijom, s obzirom na to da obnova 3′ terminala potječe iz unutarnjih predložaka i potiskuje replikaciju RNA s terminalnim delecijama[26]?
- Koji faktori domaćina i nuklearni orijentiri upravljaju formiranjem i pozicioniranjem vSPOT-ova nastalih faznim razdvajanjem potaknutim P-proteinom koji komuniciraju s kromatinom i pristaju na dvolančane lomove DNA neurona[3]?
- Kako se CRM1-ovisan izvoz nukleoproteina i energetski ovisan izvoz mRNA integriraju u regulaciju kompartmentalizacije poly(A)+ RNA naspram poly(A)− genomske RNA preko nuklearne ovojnice[13, 15, 20]?
- Kojim molekularnim mehanizmom protein X potiskuje akumulaciju minigenomske RNA i kako se ta supresija siječe s negativnom regulacijom kofaktorske aktivnosti polimeraze ovisnom o fosforilaciji P proteina[15, 23]?
