摘要
博纳病毒（例如博纳病病毒，BDV；博纳病病毒 1 型，BoDV-1）是不分节段的单股负链 RNA 病毒，其在动物不分节段负链 RNA (NNS-RNA) 病毒中最显著的特征是：基因组的转录和复制发生在宿主细胞核内，而非主要发生在细胞质中[1–3]。对 BDV 的分子研究界定了一个约 8.9–9 kb 的紧凑基因组，其具有多个开放阅读框（ORFs），这些阅读框被组织成少量的转录单元，侧翼是由顺反子外末端序列组成的，这些序列作为病毒 RNA 合成的启动子和调节边界[4–8]。基因表达过程十分复杂，包括产生单顺反子和多顺反子的 poly(A)+ RNA、终止位点的频繁通读，以及在某些转录背景下利用剪接来表达包括聚合酶 (L) 在内的关键产物[4–6, 9, 10]。功能重建和迷你基因组系统已定位了 3′ 基因组末端的顺式作用启动子需求，并表明 N 和 P 包裹的模板可被 L/P 聚合酶复合物识别，从而产生复制和转录产物[11, 12]。细胞核的组织和运输进一步塑造了复制程序，病毒“转录斑点”（vSPOTs）和 CRM1 依赖性的核蛋白输出有助于 RNP 动态以及 poly(A)+ 与 poly(A)− 病毒 RNA 的区域化[3, 13–15]。
关键词
- Bornavirus[1]
- Borna disease virus[4]
- 不分节段负链 RNA 病毒[4]
- 核内复制[2]
- 转录通读[5]
- vSPOTs[3]
- 迷你基因组[11]
- CRM1 输出[15]
- 磷蛋白 P[15]
- RNA 依赖性 RNA 聚合酶 L[16]
引言
博纳病毒属于 NNS-RNA 病毒，其启动子和基因起始共有序列与在 Mononegavirales 各科中观察到的模式一致，表明其在顺式作用启动元件水平上具有共同的负链转录逻辑[4, 17]。一个核心的机制区别在于，虽然大多数单股负链病毒主要在细胞质中复制，但博纳病毒在细胞核中复制，并在那里建立专门用于病毒 RNA 合成的核内位点[1, 3]。实验证据特别支持 BDV 的复制和转录发生在受感染细胞的细胞核中，并与具有感染性的核糖核蛋白复合物 (BDV-RNPs) 相关，强调了博纳病毒 RNA 的合成是在核内 RNPs 的背景下执行的[4, 13]。细胞分级分离进一步支持了核定位，结果显示大多数新合成的基因组极性 BDV RNA 为 poly(A)−，且主要存在于核组分中，这与基因组 RNA 的核内复制一致[13]。
基因组组织
BDV 基因组测序和图谱绘制确定了一个约为 8.9 kb 的线性基因组，预测全基因组分布有主要的开放阅读框，且两端均侧接非编码序列[4, 5]。在的一项报告中，在 8,903-nt 的 BDV 基因组序列中预测了五个主要 ORF (I–V)；而另一项对 BDV 基因组 (8,910 nt) 的描述同样指出，五个主要 ORF 具有反义信息，侧翼分别为 3′ 末端的 53 nt 非编码序列和 5′ 末端的 91 nt 非编码序列[4, 5]。除了五 ORF 框架外，反基因组水平的图谱描述了三个转录单元和六个 ORF，综述性总结同样将 BDV 描述为在三个转录单元中编码六个 ORF，并由类似于其他 NNS RNA 病毒的互补末端界定[6, 7]。
最大的编码区 (ORF V) 编码一个预测约为 170 kDa 的蛋白，与 NNS-RNA 病毒聚合酶的 L 蛋白家族具有高度同源性，根据经典的负链布局，将病毒 RNA 依赖性 RNA 聚合酶置于基因组的 5′ 近端[4]。保守序列分析确定，在推测的催化结构域中同源性最高，其不变且保守维持的残基聚集在四个高度保守的基序 (A–D) 中，这与 NNS-RNA 病毒聚合酶功能的保守酶促限制一致[18]。据报道，具有感染性的 BDV-RNPs 仅含有一种 BDV RNA 物种，即 poly(A)−、负极性的 9-kb RNA，这支持了基因组长度的 poly(A)− RNA 是感染性 RNPs 中被包裹的模板物种[13]。
博纳病毒基因组还携带 NNS-RNA 病毒典型的调节边界区域，ORF 侧翼是非翻译边界序列，其中包括转录起始和终止信号[8]。末端序列可以进行碱基配对以形成锅柄样结构，在 BDV 中，基因组末端的比对允许形成末端锅柄结构，其中前 3 个核苷酸不配对，从而将末端互补性与启动子结构联系起来，而不需要完美的双链化[5]。重要的是，对 BDV 基因组末端的分析报告称，在长期持久感染期间，既缺乏完美的末端互补性，又增加了末端序列的异质性，这表明顺式作用末端区域是多变的，但在不同感染状态下在功能上是被允许的[11]。
为了简要总结这些来源中描述的基因组和基因表达结构，下表对比了几种经常被引用的组织特征。
转录与基因表达
BDV 的博纳病毒基因表达包括多种与负链基因组互补的多聚腺苷酸化亚基因组 RNA，一项研究确定了九种多聚腺苷酸化亚基因组 RNA 物种，包括六种多顺反子 poly(A)+ RNA 以及对应于 ORF I、II 和 IV 的单顺反子 mRNA[4]。在同一分析中，未检测到 ORF III 和 V 的单顺反子 poly(A)+ RNA，这表明 BDV 中某些编码区的表达并不以简单的单顺反子信息为主[4]。Northern 分析还显示，BDV 转录单顺反子和多顺反子 RNA，并使用类似于其他负链 RNA 病毒的终止/多聚腺苷酸化信号，这与“停止-开始”转录程序一致，尽管该程序在终止位点之外仍会产生频繁的转录连续性[5]。
终止和多聚腺苷酸化涉及离散的位点和可识别的信号。Northern 杂交实验支持使用特定的终止位点 (T2, T3, T5, 和 T7)，并确定了终止/多聚腺苷酸化信号共有序列，为转录边界和通读倾向提供了分子标志[5]。与其他负链 RNA 病毒相比，BDV 还以通读转录本的高频率著称，这意味着终止效率经过系统性调节，并且在机制上可能是必不可少的[5]。事实上，T3 的通读对于 p190（聚合酶蛋白）的表达至关重要，直接将终止抑制与聚合酶的可获得性联系起来，从而与复制和转录能力联系起来[9]。
BDV mRNA 具有加帽和多聚腺苷酸化特征，表明尽管处于核内复制生态位，其 mRNA 的成熟过程与产生具有翻译能力的 RNA 是一致的[19]。剪接产生了额外的编码多样性，如 2.8-kb 和 7.1-kb RNA 含有两个内含子，它们经差异剪接产生编码包括 G 和聚合酶相关蛋白在内的多种产物的 RNA，另有说明指出 L 的表达需要剪接和终止抑制[6, 10]。在起始和启动子结构水平上，高启动子活性似乎不需要完美的末端互补性，且末端互补性的增加并没有促进 BDV 聚合酶的复制与转录比，表明复制与转录的平衡并非仅仅是末端碱基配对强度的函数[11]。
复制周期概述
博纳病毒复制的定义是核内 RNA 合成和病毒 RNPs 的核组织。多个来源提供的证据表明，BDV 的复制和转录发生在细胞核中，并与具有感染性的 BDV-RNPs 相关，证实了 RNA 合成的功能模板是在核环境中运行的 RNP 复合物[4, 13]。定量分级和标记实验进一步表明，大多数新合成的 BDV 基因组极性 RNA 是 poly(A)− 且位于核内，支持了基因组复制发生在受感染细胞核内的结论[13]。
对于不同类别的病毒 RNA，出现了一种一致的区域化模式。BDV 9-kb poly(A)− RNA 大部分位于核内，而新合成的 poly(A)+ RNA 被运输到细胞质室，表明 mRNA 输出和基因组保留在核被膜两侧是分离的[13, 14]。BDV mRNA 的转运已被证明是能量依赖性的，这意味着主动输出而非被动扩散是核内博纳病毒感染中基因表达的关键控制点[20]。
博纳病毒还在核内组装被称为“病毒转录斑点”(vSPOTs) 的病毒工厂，为核内集中的转录/复制和潜在的协调 RNA 加工提供结构背景[1]。在 BoDV-1 中，由 P 蛋白驱动的液-液相分离形成的 vSPOTs 存在于细胞核中并与染色质密切相互作用，包括锚定在神经元 DNA 双链断裂处，将复制位点与特定的核下结构联系起来[3]。与 RNPs 的核心地位一致，据报道，仅含有 9-kb RNA 物种的 BDV-RNP 复合物具有转录所需的聚合酶活性，并携带指导 BDV 大分子合成和产生感染性 BDV 颗粒所需的遗传信息，从而将基因组长度的 RNPs 与病毒生命周期的后续步骤联系起来[21]。
RNP 与聚合酶机制
BDV 基因组长度的 RNA 被包装成含有 N 和病毒 RNA 依赖性 RNA 聚合酶复合物的 RNP 复合物，将核心机制定义为结合了聚合酶复合物的核壳模板[15]。RdRp 复合物由 P 和 L 组成，负责病毒基因组的复制和转录，确定了 L 是催化亚基，而 P 是 BDV 中必不可少的聚合酶辅因子[15]。结构和功能描述进一步将 L 定义为约为 192 kDa 的 RdRp，构成了复制复合物的核心，执行转录和复制以产生病毒 mRNA 和新的基因组拷贝，并与 P 结合以实现高效的 RNA 合成[16]。
P 蛋白的相互作用特性为聚合酶功能提供了机制见解。P 通过中央寡聚化结构域自缔合成寡聚体，并架起 RdRp 与核壳之间的桥梁，它还充当 N 的分子伴侣，使其维持在复制所需的无 RNA 形式，支持了 P 协调酶招募和模板就绪的模型[3]。一致地，在迷你复制子测定中对 P 寡聚化的实验破坏研究了寡聚化缺陷的 P 突变体是否能重建功能性聚合酶复合物，结果没有一个 P 突变体支持报告基因表达，表明在这些条件下聚合酶活性需要 P 寡聚化[22]。此外，P 对 BDV RdRp 的辅因子活性受到磷酸化的负向调节，为聚合酶功能提供了一个明确的翻译后调节杠杆[15]。
博纳病毒核蛋白异构体也将蛋白质功能与细胞内定位联系起来。表达 p40 和 p38 的实验显示，p40 主要位于核内，而 p38 主要位于细胞质，然而两者都能结合博纳病毒磷蛋白 P，表明异构体依赖性定位与 P 结合相结合，可能会调节 RNP 组装和/或功能发生的地点[9]。与 P 的核靶向作用一致，P 在其氨基末端包含一个强效的双分核定位信号 (NLS) 和其他较弱的 NLS 基序，支持含聚合酶复合物的核输入是核内 RNA 合成的机制前提[9]。
最后，辅助蛋白 X 可以在重建系统中直接下调 RNA 合成。当在表达 X 蛋白的细胞中重建 BDV 聚合酶复合物时，未检测到正链迷你基因组 RNA，这表明在该测定背景下，X 抑制了病毒的转录和复制[23]。这些观察结果共同支持了一个机制模型，即 L 和 P 构成催化核心，P 寡聚化和磷酸化调节聚合酶能力，而辅助因子（如 X）可以在特定条件下抑制聚合酶输出[15, 23]。
核内运输
博纳病毒将核内复制与 RNP 组件和 RNA 物种的受控核质运输相结合。直接证据表明，BDV 的复制和转录发生在存在感染性 BDV RNPs 的细胞核中，分级分离表明新合成的基因组极性 RNA 在核组分中显著富集，这为核输入和输出途径协调生命周期提供了功能动力[13, 21]。RNA 转运测定表明，新合成的 BDV poly(A)+ RNA 被高效地转运到细胞质室，而 9-kb 基因组 RNA 大部分保留在核内，展示了 RNA 类别特异性的输出行为[14]。此外，mRNA 转运是能量依赖性的，在缺乏 ATP 的情况下输出微乎其微，支持病毒 mRNA 存在主动的、依赖宿主因子的输出机制[20]。
对于蛋白质运输，核蛋白涉及 CRM1 依赖性输出。N 的核输出是通过与 NES 一致的 CRM1 依赖性途径进行的，另一项声明同样报告 BoDV-N 的核输出通过 CRM1 依赖性途径发生，表明这种输出路径在博纳病毒中具有保守性[15, 24]。更广泛的综述进一步指出，多种 BDV 蛋白（包括核蛋白、磷蛋白、X 和 L）有助于 BDV RNP 的核质运输，且方向控制可能取决于 RNP 中 NLS 和 NES 元件的比例和相互作用，将运输框架化为竞争性定位信号的涌现属性，而非单一决定因素[25]。
核内病毒工厂的形成提供了另一个与运输相关的组织层级。博纳病毒在细胞核中组装 vSPOTs，BoDV-1 的 vSPOTs 由 P 蛋白驱动的液-液相分离形成，并与染色质密切相互作用，这可以限制扩散并潜在地指导转录/复制位点相对于宿主核标志物的定位[1, 3]。
反向遗传学与启动子元件
博纳病毒的顺式作用调节信号集中在非翻译边界和末端区域。在 BDV 中，ORF 侧翼是非翻译边界序列，其中包含转录起始和终止的调节信号，这与类 Mononegavirales 架构一致，即基因起始和基因末端信号引导聚合酶沿基因组运行[8]。推导出的 BDV 起始共有序列 (UNCNNNUUNN) 与通过比较多个 Mononegavirales 家族的 NNS-RNA 病毒推断出的序列相同，支持了聚合酶机制所使用的起始基序的保守性[4, 17]。终止/多聚腺苷酸化信号包括每个终止/多聚腺苷酸化信号 5′ 端的保守 AUUUUU 六聚体，后跟 GG（或 ORF II 中的 CG），而在一项分析中无法确定 ORF III 的假定信号，表明在跨基因边界的基序可检测性方面既存在保守性也存在缺失[4]。
反向遗传学和迷你基因组方法已直接测试了这些调节元件。建立了一种用于胞内重建 BDV RNA 复制和转录的 RNA 聚合酶 I/聚合酶 II 系统，从而能够对照剖析顺式和反式作用的需求[11]。在该系统中，BDV RNA 类似物（迷你基因组）由细胞 RNA 聚合酶 I 合成，并包含 BDV 聚合酶介导的 RNA 合成所需的 BDV 5′ 和 3′ 非翻译顺式作用序列，将末端区域与细胞中的启动子功能联系起来[11]。由质粒提供的 BDV N 和 P 对聚合酶 I 来源的迷你基因组 RNA 进行包裹，产生一个被重组 BDV 聚合酶识别的模板，以指导全长反迷你基因组 RNA 的合成（复制）和编码报告基因的亚基因组 mRNA 的合成，实验证明 N 和 P 的包裹足以使 RNA 具备聚合酶识别和双重输出 RNA 合成的能力[11]。
启动子图谱分析进一步完善了顺式作用模型。下游序列（第 25 到 33 位核苷酸）是实现最佳启动子活性所必需的，且在该背景下缺失第 34 到 35 位核苷酸会废除报告基因活性，从而确定了 3′ 基因组启动子区域中简短且具有位置特异性的启动子近端需求[12]。总之，这些数据支持了一种启动子结构，即紧凑的末端序列和附近的下游元件在重组聚合酶系统中控制起始和有效的复制/转录[11, 12]。
持久感染机制
博纳病毒的分子持久性与基因组末端动态、核内复制和专门的核组织有关。“重新对齐与延伸”（realign-and-elongation）过程在每一轮复制期间从内部模板更新 v- 和 cRNA 分子的 3′ 末端，且仅在末端完整时才能发生，这提供了一个明确的机制步骤，作为基因组完整性的质量控制检查点[26]。该过程提供了集成的质量控制，抑制了末端缺失 RNA 分子的复制，将末端修复逻辑与针对缺陷复制中间体的选择联系起来[26]。与此同时，对长期持久感染期间基因组末端的分析报告称，与急性期相比，来自持久感染细胞的 RNA 具有更高程度的末端异质性，表明持久感染伴随着基因组末端变体分布的转变[11]。
持久感染还与 RNPs 稳定的核环境有关。据描述，博纳病毒在已知的动物 NNS RNA 病毒中是唯一在细胞核内进行复制和转录的，这为长期非细胞溶解性 RNA 合成和核内基因组末端加工提供了细胞区域环境[2]。此外，BoDV-1 利用宿主染色质作为支架构建其 vRNPs，这一特性可以通过稳定 vRNP 相对于染色质的定位，从机制上支持其在核内的持久存在[27]。
宿主反应调节也已在实验中与感染状态联系起来。在 Pam3CSK4 激活后，BDV 感染的细胞分泌的 SEAP 少于模拟感染细胞，表明 BDV 感染的细胞主动抑制 NF-κB 信号传导，这为持久感染期间天然免疫信号的改变提供了分子水平的相关性[28]。
待解答的问题
基于上述总结的机制发现，仍有几个分子层面的问题尚待解答或需进行有针对性的实验。
- 哪些序列和结构决定因素控制了 BDV 的终止效率和通读转录本的高频率，特别是在通读对聚合酶表达至关重要的 T3 位点[5, 9]？
- 2.8-kb 和 7.1-kb RNA 中的替代剪接事件如何与转录边界的使用相互作用，以产生正确化学计量的 G 和聚合酶相关产物，包括 L 表达需要剪接和终止抑制的情况[6, 10]？
- 鉴于高启动子活性不需要完美的末端互补性且末端在长期感染期间会发生多样化，持久感染期间观察到的末端异质性与启动子活性之间的定量关系是什么[11]？
- 鉴于 3′ 末端更新源自内部模板并抑制末端缺失 RNA 的复制，重新对齐与延伸质量控制步骤如何与核内 RNP 组织相协调[26]？
- 哪些宿主因子和核标志物支配着 P 驱动的、能与染色质相互作用并锚定在神经元 DNA 双链断裂处的相分离 vSPOTs 的形成和定位[3]？
- CRM1 依赖性的核蛋白输出和能量依赖性的 mRNA 输出如何整合，以调节 poly(A)+ RNA 与 poly(A)− 基因组 RNA 跨核被膜的区域化[13, 15, 20]？
- X 蛋白通过何种分子机制抑制迷你基因组 RNA 的积累，以及这种抑制如何与 P 磷酸化依赖性的聚合酶辅因子活性负向调节相交叉[15, 23]？
