Tiivistelmä
Bornavirukset (esim. Borna disease virus, BDV; Borna disease virus 1, BoDV-1) ovat segmentoitumattomia, negatiivisäikeisiä yksisäikeisiä RNA-viruksia, joiden erottuvin piirre eläinten segmentoitumattomien negatiivisäikeisten RNA-virusten (NNS-RNA) joukossa on se, että genomin transkriptio ja replikaatio tapahtuvat isäntäsolun tumassa sytoplasman sijaan[1–3]. BDV:n molekyylitutkimukset ovat määritelleet kompaktin ~8,9–9 kb genomin, jossa on useita avoimia lukukehyksiä järjestettynä pieneen määrään transkriptioyksiköitä, joita ympäröivät ekstrasistroniset terminaalisekvenssit, jotka toimivat promoottoreina ja säätelyrajoina viruksen RNA-synteesille[4–8]. Geeniekspressio on monimutkaista ja sisältää sekä mono- että polysistronisten poly(A)+ RNA-molekyylien tuotantoa, tiheää läpilukua terminaatiokohdissa sekä silminkoinnin käyttöä keskeisten tuotteiden, kuten polymeraasin (L), ilmentämiseen tietyissä transkriptikonteksteissa[4–6, 9, 10]. Funktionaalinen rekonstituutio ja minigenomijärjestelmät ovat kartoittaneet cis-vaikutteisia promoottorivaatimuksia 3′-genomipäässä ja osoittaneet, että N ja P kapsidoivat templaatteja, jotka L/P-polymeraasikompleksi tunnistaa tuottaakseen sekä replikatiivisia että transkriptiotuotteita[11, 12]. Tuman organisaatio ja kuljetusliikenne muokkaavat edelleen replikaatio-ohjelmaa, jossa viruksen ”transkriptiotäplät” (vSPOTs) ja CRM1-riippuvainen nukleoproteiinin vienti vaikuttavat RNP-dynamiikkaan ja poly(A)+- ja poly(A)−-virus-RNA-molekyylien osastointiin[3, 13–15].
Avainsanat
- Bornavirus[1]
- Borna disease virus[4]
- nonsegmented negative-strand RNA virus[4]
- nuclear replication[2]
- transcription readthrough[5]
- vSPOTs[3]
- minigenome[11]
- CRM1 export[15]
- phosphoprotein P[15]
- RNA-dependent RNA polymerase L[16]
Johdanto
Bornavirukset ovat NNS-RNA-viruksia, joiden promoottori- ja geenin alkukohtien konsensussekvenssit noudattavat Mononegavirales-heimojen välillä havaittuja malleja, mikä viittaa jaettuun negatiivisäikeiseen transkriptiologiikkaan cis-vaikutteisten initiaatioelementtien tasolla[4, 17]. Keskeinen mekanistinen ero on se, että vaikka useimmat mononegavirukset replikoituvat pääasiassa sytoplasmassa, bornavirukset replikoituvat tumassa, jonne ne muodostavat erikoistuneita tumakohtia viruksen RNA-synteesiä varten[1, 3]. Kokeellinen näyttö tukee erityisesti sitä, että BDV-replikaatio ja -transkriptio tapahtuvat infektoitujen solujen tumissa ja liittyvät infektiivisiin ribonukleoproteiinikomplekseihin (BDV-RNPs), mikä korostaa, että bornaviruksen RNA-synteesi suoritetaan tumassa sijaitsevien RNP-kompleksien yhteydessä[4, 13]. Tumalokalisointia tukee edelleen solufraktionointi, joka osoittaa, että suurin osa vastasydetoidusta genomipolariteetin BDV-RNA:sta on poly(A)−-muodossa ja löytyy pääosin tumafraktiosta, mikä on yhdenmukaista genomisen RNA:n tumareplikaation kanssa[13].
Genomin organisaatio
BDV-genomin sekvensointi ja kartoitus tunnistivat lineaarisen ~8,9 kb genomin, jossa on ennustettu olevan merkittäviä avoimia lukukehyksiä koko genomin alueella ja joita reunustavat koodaamattomat sekvenssit molemmissa päissä[4, 5]. Eräässä raportissa ennustettiin viisi suurta ORF-aluetta (I–V) 8 903 nt:n BDV-genomisekvenssissä, kun taas toisessa BDV-genomin kuvauksessa (8 910 nt) todettiin vastaavasti antisenssi-informaatiota viidelle suurelle ORF-alueelle, joita reunustavat 53 nt:n koodaamaton sekvenssi 3′-päässä ja 91 nt 5′-päässä[4, 5]. Viiden ORF-alueen rakenteen lisäksi antigenomitasoinen kartoitus on kuvannut kolme transkriptioyksikköä ja kuusi ORF-aluetta, ja katsausartikkelit kuvaavat vastaavasti BDV:n koodaavan kuutta ORF-aluetta kolmessa transkriptioyksikössä, joita reunustavat komplementaariset päät muiden NNS-RNA-virusten tapaan[6, 7].
Suurin koodaava alue (ORF V) koodaa ennustettua ~170 kDa:n proteiinia, jolla on vahva homologia NNS-RNA-virusten polymeraasien L-proteiiniperheen kanssa, mikä sijoittaa viruksen RNA-riippuvaisen RNA-polymeraasin geenisarjan 5′-proksimaaliseen päähän kanonisessa negatiivisäikeisessä rakenteessa[4]. Konservoitunut sekvenssianalyysi tunnisti suurimman homologian oletetussa katalyyttisessä domeenissa, jossa invariantit ja konservoituneet residuut ryhmittyvät neljään erittäin konservoituneeseen motiiviin (A–D), mikä on linjassa NNS-RNA-virusten polymeraasitoimintaan kohdistuvien konservoituneiden entsymaattisten rajoitteiden kanssa[18]. Infektiivisten BDV-RNP-kompleksien on raportoitu sisältävän vain yhden BDV-RNA-lajin, poly(A)−, negatiivipolariteettisen 9 kb RNA:n, mikä tukee sitä, että genomin mittainen poly(A)− RNA on kapsidoitu templaattilaji infektiivisissä RNP-komplekseissa[13].
Bornavirusgenomit kantavat myös NNS-RNA-viruksille tyypillisiä säätelyrajavyöhykkeitä, joissa ORF-alueita reunustavat translaatiota edeltävät rajasekvenssit, jotka sisältävät transkription aloitus- ja lopetussignaalit[8]. Terminaalisekvenssit voivat muodostaa emäspariutumisen kautta "panhandle"-rakenteen, ja BDV:ssä genomisten päiden suuntaus salli terminaalisen silmukan muodostumisen, jossa ensimmäiset 3 nukleotidia olivat parittomia, yhdistäen terminaalisen komplementaarisuuden promoottoriarkkitehtuuriin ilman täydellisen dupleksin vaatimusta[5]. On tärkeää huomata, että BDV:n genomisten päiden analyysit raportoivat sekä täydellisen terminaalisen komplementaarisuuden puutteen että lisääntyneen terminaalisen sekvenssiheterogeenisyyden pitkäaikaisen persistenssin aikana, mikä osoittaa, että cis-vaikutteiset terminaaliset alueet ovat vaihtelevia mutta toiminnallisesti siedettyjä eri infektiotiloissa[11].
Genomin ja geeniekspression arkkitehtuurin tiivistämiseksi alla oleva taulukko vertailee useita usein viitattuja organisatorisia piirteitä.
Transkriptio ja geeniekspressio
Bornaviruksen geeniekspressio BDV:ssä sisältää useita polyadenyloituja subgenomisia RNA-molekyylejä, jotka ovat komplementaarisia negatiivisäikeiselle genomille. Eräässä tutkimuksessa tunnistettiin yhdeksän polyadenyloitua subgenomista RNA-lajia, mukaan lukien kuusi polysistronista poly(A)+ RNA:ta ja monosistronisia mRNA-molekyylejä, jotka vastaavat ORF-alueita I, II ja IV[4]. Samassa analyysissä ei havaittu monosistronisia poly(A)+ RNA-molekyylejä ORF III:lle ja V:lle, mikä osoittaa, ettei joidenkin koodausalueiden ilmentymistä hallitse BDV:ssä pelkät monosistroniset viestit[4]. Northern-analyysit osoittivat myös, että BDV transkriboi sekä mono- että polysistronisia RNA-molekyylejä ja käyttää terminaatio/polyadenylaatiosignaaleja, jotka muistuttavat muita negatiivisäikeisiä RNA-viruksia, mikä on linjassa stop–start-transkriptio-ohjelman kanssa, joka kuitenkin tuottaa usein jatkuvia transkripteja terminaatiokohtien ohi[5].
Terminaatio ja polyadenylaatio tapahtuvat erillisissä kohdissa ja tunnistettavan signaalin avulla. Northern-hybridisaatiokokeet tukivat tiettyjen terminaatiokohtien (T2, T3, T5 ja T7) käyttöä ja tunnistivat terminaatio/polyadenylaatiosignaalin konsensussekvenssin, mikä tarjosi molekulaariset maamerkit transkriptien rajoille ja läpilukutaipumukselle[5]. BDV on myös huomattava läpilukutranskriptien korkean esiintyvyyden vuoksi verrattuna muihin negatiivisäikeisiin RNA-viruksiin, mikä viittaa siihen, että terminaation tehokkuus on järjestelmällisesti säädeltyä ja voi olla mekanistisesti välttämätöntä[5]. Itse asiassa T3:n läpiluku on välttämätöntä p190:n (polymeraasiproteiini) ilmentymiselle, mikä yhdistää terminaation vaimennuksen suoraan polymeraasin saatavuuteen ja siten replikaatio- ja transkriptiokapasiteettiin[9].
BDV-mRNA:t ovat kätpättyjä ja polyadenyloituja, mikä osoittaa, että mRNA:n kypsyminen on yhdenmukaista translaatiokelpoisten RNA-molekyylien tuotannon kanssa tumareplikaatiosta huolimatta[19]. Koodauksen monimuotoisuutta lisää edelleen silminkointi, sillä 2,8 kb:n ja 7,1 kb:n RNA-molekyylit sisältävät kaksi intronia, jotka silminkoidaan eri tavoin sellaisten RNA-molekyylien tuottamiseksi, jotka koodaavat useita tuotteita, mukaan lukien G ja polymeraasiin liittyvät proteiinit; erilliset havainnot osoittavat, että L-ilmentyminen vaatii sekä silminkointia että terminaation vaimennusta[6, 10]. Initiaation ja promoottorirakenteen tasolla täydellistä terminaalista komplementaarisuutta ei vaikuta tarvittavan korkeaan promoottoriaktiivisuuteen, eikä lisääntynyt terminaalinen komplementaarisuus edistänyt replikaatiota transkription kustannuksella BDV-polymeraasin toimesta, mikä osoittaa, ettei replikaation ja transkription välinen tasapaino ole pelkästään terminaalisen emäspariutumisvoiman funktio[11].
Replikaatiosyklin yleiskatsaus
Bornaviruksen replikaatiota määrittää tuman RNA-synteesi ja viruksen RNP-kompleksien tumaorganisaatio. Useat lähteet antavat näyttöä siitä, että BDV-replikaatio ja -transkriptio tapahtuvat tumassa liittyen infektiivisiin BDV-RNP-komplekseihin, mikä osoittaa, että RNA-synteesin funktionaalinen templaatti on tumaympäristössä toimiva RNP-kompleksi[4, 13]. Kvantitatiiviset fraktionointi- ja merkintäkokeet osoittivat edelleen, että suurin osa vastasydetoidusta BDV-genomipolariteetin RNA-molekyyleistä on poly(A)− ja tumassa sijaitsevia, mikä tukee johtopäätöstä, että genomin replikaatio tapahtuu infektoitun solun tumassa[13].
Eri virus-RNA-luokille muodostuu johdonmukainen osastoitumismalli. BDV 9 kb poly(A)− RNA on pääosin tumassa, kun taas vastasydetoidut poly(A)+ RNA-molekyylit kuljetetaan sytoplasmaan, mikä osoittaa, että mRNA:n vienti ja genomin retentio on erotettu tumakalvon yli[13, 14]. BDV-mRNA-molekyylien kuljetuksen on osoitettu olevan energiariippuvaista, mikä viittaa aktiiviseen vientiin passiivisen diffuusion sijaan keskeisenä geeniekspression säätelypisteenä tuman bornavirusinfektiossa[20].
Bornavirukset muodostavat myös tuman virus-tehtaita, joita kutsutaan nimellä ”viral Speckles Of Transcripts” (vSPOTs), mikä tarjoaa rakenteellisen kontekstin keskitetylle transkriptiolle/replikaatiolle ja mahdollisesti koordinoidulle RNA-prosessoinnille tumassa[1]. BoDV-1:ssä P-proteiinin ohjaaman neste-neste-faasiseparation muodostamat vSPOT-rakenteet sijaitsevat tumassa ja ovat tiiviissä vuorovaikutuksessa kromatiinin kanssa, mukaan lukien kiinnittyminen hermosolujen DNA:n kaksoissidoskatkoksiin, yhdistäen replikaatiokohdat tiettyihin tuman alarakenteisiin[3]. RNP-keskeisyyden mukaisesti BDV-RNP-kompleksien, jotka sisältävät vain 9 kb RNA-lajin, on raportoitu omaavan transkriptioon tarvittavaa polymeraasiaktiivisuutta ja kantavan geneettistä tietoa, jota tarvitaan ohjaamaan BDV-makromolekyylien synteesiä ja infektiivisten BDV-partikkelien tuotantoa, yhdistäen genomin mittaiset RNP:t viruksen elinkierron myöhempiin vaiheisiin[21].
RNP- ja polymeraasikoneisto
BDV:n genomin mittainen RNA on pakattu RNP-komplekseihin, jotka sisältävät N-proteiinia ja viruksen RNA-riippuvaisen RNA-polymeraasikompleksin, määritellen ydinkoneistoksi polymeraasikompleksin sitoman nukleokapsiditemplaatin[15]. RdRp-kompleksi koostuu P- ja L-proteiineista ja vastaa viruksen genomin replikaatiosta ja transkriptiosta, tehden L-proteiinista katalyyttisen alayksikön ja P-proteiinista välttämättömän polymeraasikofaktorin BDV:ssä[15]. Rakenteelliset ja toiminnalliset kuvaukset määrittelevät edelleen L-proteiinin ~192 kDa:n RdRp-entsyymiksi, joka muodostaa replikaatiokompleksin ytimen, suorittaa transkriptiota ja replikaatiota tuottaakseen viruksen mRNA:ta ja uusia genomikopioita, ja liittyy P-proteiiniin tehokasta RNA-synteesiä varten[16].
P-proteiinin vuorovaikutusominaisuudet tarjoavat mekanistista tietoa polymeraasin toiminnasta. P assosioituu oligomeereiksi keskellä sijaitsevan oligomerisaatiodomeenin kautta ja toimii siltana RdRp:n ja nukleokapsidin välillä. Se toimii myös N-proteiinin kaperonina pitäen sen RNA-vapaassa muodossa, jota tarvitaan replikaatiossa, mikä tukee mallia, jossa P koordinoi sekä entsyymin rekrytointia että templaatin valmiutta[3]. Johdonmukaisesti kokeellinen P-oligomerisaation häiritseminen minireplikonimäärityksessä selvitti, voisivatko oligomerisaatiovialliset P-mutantit muodostaa toiminnallisia polymeraasikomplekseja; yksikään P-mutanteista ei tukenut raporttigeenin ilmentymistä, mikä osoittaa, että P-oligomerisaatio on välttämätöntä polymeraasiaktiivisuudelle näissä olosuhteissa[22]. Lisäksi fosforylaatio säätelee negatiivisesti P-proteiinin kofaktoriaktiivisuutta BDV RdRp:lle, tarjoten suoran post-translationaalisen säätelymekanismin polymeraasitoiminnalle[15].
Bornaviruksen nukleoproteiini-isoformit yhdistävät myös proteiinin toiminnan solunsisäiseen lokalisointiin. Kokeet, joissa ilmennettiin p40- ja p38-proteiineja, osoittivat, että p40 on ensisijaisesti tumassa sijaitseva, kun taas p38 on ensisijaisesti sytoplasminen, mutta molemmat sitoutuvat BDV-fosfoproteiini P:hen. Tämä viittaa siihen, että isoformista riippuva lokalisointi kytkettynä P-sitoutumiseen saattaa moduloida sitä, missä RNP-kokoaminen ja/tai toiminta tapahtuu[9]. P-proteiinin tumahakuisen roolin mukaisesti P sisältää vahvan bipartitiivisen tumalokalisointisignaalin (NLS) amino-päässään sekä muita heikompia NLS-motiiveja, mikä tukee polymeraasia sisältävien kompleksien tumaantuontia mekanistisena edellytyksenä tuman RNA-synteesille[9].
Lopuksi apuproteiini X voi suoraan vaimentaa RNA-synteesiä rekonstituoiduissa järjestelmissä. Kun BDV-polymeraasikompleksit muodostettiin soluissa, jotka ilmentävät X-proteiinia, plus-säikeistä minigenomi-RNA:ta ei havaittu, mikä viittaa siihen, että X estää sekä viruksen transkriptiota että replikaatiota kyseisessä koeasetelmassa[23]. Nämä havainnot yhdessä tukevat koneistomallia, jossa L ja P muodostavat katalyyttisen ytimen, P-oligomerisaatio ja -fosforylaatio säätelevät polymeraasin kompetenssia, ja apuproteiinit, kuten X, voivat estää polymeraasin toimintaa määritellyissä olosuhteissa[15, 23].
Tumakuljetus
Bornavirukset kytkevät tumareplikaation säädeltyyn RNP-komponenttien ja RNA-lajien nukleosytoplasmiseen kuljetukseen. Suora näyttö osoittaa, että BDV-replikaatio ja -transkriptio tapahtuvat tumissa, joissa on infektiivisiä BDV-RNP-komplekseja, ja fraktionointi osoittaa, että vastasyntynyt genomipolariteetin RNA on voimakkaasti rikastunut tumafraktioon, mikä antaa funktionaalisen sysäyksen tumaantuonti- ja vientireiteille elinkierron koordinoimiseksi[13, 21]. RNA-kuljetusmääritykset osoittavat, että vastasydetoidut BDV poly(A)+ RNA-molekyylit kuljetetaan tehokkaasti sytoplasmaan, kun taas 9 kb genominen RNA jää pääosin tumaan, mikä osoittaa RNA-luokkakohtaista vientikäyttäytymistä[14]. Lisäksi mRNA-kuljetus on energiariippuvaista, ja vienti on merkityksetöntä ATP:n puuttuessa, mikä tukee aktiivisia, isäntätekijöistä riippuvaisia vientimekanismeja viruksen mRNA-molekyyleille[20].
Proteiinien kuljetuksessa CRM1-riippuvainen vienti on osallisena nukleoproteiinille. N-proteiinin tumastavienti tapahtuu CRM1-riippuvaisen reitin kautta, mikä on linjassa NES-signaalin kanssa, ja erillinen raportti osoittaa vastaavasti, että BoDV-N:n tumastavienti tapahtuu CRM1-riippuvaisen reitin kautta, mikä viittaa tämän vientireitin konservoituneisuuteen bornaviruksissa[15, 24]. Laajemmat katsaukset toteavat lisäksi, että useat BDV-proteiinit (mukaan lukien nukleoproteiini, fosfoproteiini, X ja L) osallistuvat BDV-RNP:n nukleosytoplasmiseen kuljetukseen, ja että suunnan hallinta määräytyy todennäköisesti RNP-kompleksin NLS- ja NES-elementtien suhteiden ja vuorovaikutusten perusteella. Tämä kehystää kuljetuksen kilpailevien lokalisointisignaalien seurauksena pikemminkin kuin yhden määräävän tekijän tuloksena[25].
Tuman virus-tehtaiden muodostuminen tarjoaa kuljetuksen kannalta merkityksellisen organisatorisen tason. Bornavirukset muodostavat vSPOT-rakenteita tumassa, ja BoDV-1-vSPOTit muodostuvat P-proteiinin ohjaaman neste-neste-faasiseparation kautta ja ovat tiiviissä vuorovaikutuksessa kromatiinin kanssa, mikä voi rajoittaa diffuusiota ja mahdollisesti ohjata transkriptio/replikaatiokohtien sijoittumista suhteessa isäntäsolun tuman maamerkkeihin[1, 3].
Käänteinen genetiikka ja promoottorielementit
Bornaviruksen cis-vaikutteiset säätelysignaalit ovat keskittyneet koodaamattomiin raja- ja terminaalialueisiin. BDV:ssä ORF-alueita reunustavat koodaamattomat rajasekvenssit, jotka sisältävät säätelysignaaleja transkription aloitukselle ja lopetukselle, mikä on linjassa Mononegavirales-tyyppisen arkkitehtuurin kanssa, jossa geenin alku- ja loppusignaalit ohjaavat polymeraasin toimintaa genomilla[8]. Päätelty BDV-alkukonsensussekvenssi (UNCNNNUUNN) on identtinen sen kanssa, mikä on johdettu vertailemalla NNS-RNA-viruksia useissa Mononegavirales-heimoissa, mikä tukee polymeraasikoneiston käyttämän initiaatiomotiivin konservoituneisuutta[4, 17]. Terminaatio/polyadenylaatiosignaalit sisältävät konservoituneen AUUUUU-heksameerin kunkin terminaatio/polyadenylaatiosignaalin 5′-päässä, jota seuraa GG (tai CG ORF II:ssa), kun taas oletettuja signaaleja ei voitu tunnistaa ORF III:lle eräässä analyysissä, mikä osoittaa sekä konservoituneisuutta että aukkoja motiivien tunnistettavuudessa geenirajojen yli[4].
Käänteisen genetiikan ja minigenomimenetelmät ovat suoraan testanneet näitä säätelyelementtejä. RNA-polymeraasi I/polymeraasi II -järjestelmä kehitettiin BDV-RNA:n replikaation ja transkription solunsisäiseen rekonstituutioon, mikä mahdollisti cis- ja trans-vaikutteisten vaatimusten kontrolloidun analyysin[11]. Tässä järjestelmässä solun RNA-polymeraasi I syntetisoi BDV-RNA-analogin (minigenomi), joka sisältää BDV:n 5′- ja 3′-pään koodaamattomat cis-vaikutteiset sekvenssit, joita tarvitaan BDV-polymeraasivälitteiseen RNA-synteesiin, yhdistäen terminaaliset alueet promoottoritoimintaan soluissa[11]. Polymeraasi I:stä peräisin olevan minigenomi-RNA:n kapsidointi plasmidien tuottamilla BDV N- ja P-proteiineilla luo templaatin, jonka rekonstituoitu BDV-polymeraasi tunnistaa ohjatakseen täyspitkän antiminigenomi-RNA:n synteesiä (replikaatio) ja raporttigeeniä koodaavan subgenomisen mRNA:n synteesiä. Tämä osoittaa kokeellisesti, että N- ja P-kapsidointi on riittävä tekemään RNA:sta polymeraasin tunnistettavan ja mahdollistamaan RNA-synteesin molemmat muodot[11].
Promoottorikartoitus tarkentaa edelleen cis-vaikutteista mallia. Myöhemmät sekvenssit (nukleotidit 25–33) olivat välttämättömiä optimaaliselle promoottoriaktiivisuudelle, ja nukleotidien 34–35 poistaminen esti raporttigeenin aktiivisuuden tässä kontekstissa, tunnistaen lyhyitä, paikkaspesifisiä promoottoriproksimaalisia vaatimuksia 3′-genomipromoottorialueella[12]. Nämä tiedot tukevat yhdessä promoottoriarkkitehtuuria, jossa kompaktit terminaalisekvenssit ja läheiset alavirran elementit hallitsevat initiaatiota ja tuottavaa replikaatiota/transkriptiota rekonstituoidussa polymeraasijärjestelmässä[11, 12].
Persistenssimekanismit
Bornaviruksen molekulaarinen persistenssi on kytketty genomin päiden dynamiikkaan, tumareplikaatioon ja erikoistuneeseen tumaorganisaatioon. ”Realign-and-elongation”-prosessi uudistaa v- ja cRNA-molekyylien 3′-päät sisäisistä templaateista jokaisen replikaatiokierroksen aikana ja voi tapahtua vain, jos päät ovat täydelliset, tarjoten suoran mekanistisen vaiheen, joka toimii genomin eheydelle laadunvalvontapisteenä[26]. Tämä prosessi tarjoaa integroidun laadunvalvonnan, joka vaimentaa sellaisten RNA-molekyylien replikaatiota, joissa on terminaalisia deleetioita, yhdistäen päiden korjauslogiikan selektioon viallisia replikaatiovälivaiheita vastaan[26]. Samaan aikaan genomisten päiden analyysit pitkäaikaisen persistentin infektion aikana raportoivat korkeammasta terminaalisesta heterogeenisyydestä persistentisti infektoitujen solujen RNA-molekyyleissä verrattuna akuutteihin aikapisteisiin, mikä osoittaa, että persistenssiin liittyy muutoksia genomin päätevarianttien jakautumisessa[11].
Persistenssi liittyy myös RNP-kompleksien vakaaseen tumaympäristöön. Bornaviruksia on kuvattu ainutlaatuisiksi tunnettujen eläinten NNS-RNA-virusten joukossa niiden replikoituessa ja transkriboituessa tumassa, mikä tarjoaa solun osastoympäristön pitkäaikaiselle ei-sytolyyttiselle RNA-synteesille ja tuman genomin päiden prosessoinnille[2]. Lisäksi BoDV-1 rakentaa vRNP-kompleksinsa käyttäen isäntäsolun kromatiinia tukirankana, ominaisuus joka voi mekanistisesti tukea persistenssiä tumassa stabiloimalla vRNP:n sijaintia suhteessa kromatiiniin[27].
Isäntävasteen modulaatio on myös kokeellisesti yhdistetty infektiotiloihin. BDV-infektoidut solut erittivät vähemmän SEAP-proteiinia kuin kontrollisolut Pam3CSK4-aktivaation jälkeen, mikä viittaa siihen, että BDV-infektoidut solut vaimentavat aktiivisesti NF-κB-signalointia. Tämä tarjoaa molekyylitason vastineen muuttuneelle synnynnäiselle signaloinnille persistentin infektion aikana[28].
Avoimia kysymyksiä
Useat molekulaariset kysymykset ovat edelleen avoimia tai odottavat kohdennettua tutkimusta yllä kuvattujen mekanististen havaintojen perusteella.
- Mitkä sekvenssi- ja rakennetekijät säätelevät BDV-terminaation tehokkuutta ja läpilukutranskriptien korkeaa esiintyvyyttä, erityisesti T3-kohdassa, jossa läpiluku on välttämätöntä polymeraasin ilmentymiselle[5, 9]?
- Miten vaihtoehtoiset silminkointitapahtumat 2,8 kb:n ja 7,1 kb:n RNA-molekyyleissä ovat vuorovaikutuksessa transkriptiorajojen käytön kanssa oikeiden G- ja polymeraasiin liittyvien tuotteiden stökiometrioiden saavuttamiseksi, mukaan lukien tapaukset, joissa L-ilmentyminen vaatii silminkointia ja terminaation vaimennusta[6, 10]?
- Mikä on kvantitatiivinen suhde persistenssin aikana havaitun terminaalisen heterogeenisyyden ja promoottoriaktiivisuuden välillä, kun otetaan huomioon, ettei täydellistä terminaalista komplementaarisuutta tarvita korkeaan promoottoriaktiivisuuteen ja päät monimuotoistuvat pitkäaikaisen infektion aikana[11]?
- Miten "realign-and-elongation"-laadunvalvontavaihe koordinoidaan tuman RNP-organisaation kanssa, kun otetaan huomioon, että 3′-päiden uudistuminen juontuu sisäisistä templaateista ja vaimentaa terminaalisesti deletoitujen RNA-molekyylien replikaatiota[26]?
- Mitkä isäntätekijät ja tuman maamerkit hallitsevat P-ohjattujen faasiseparoituneiden vSPOT-rakenteiden muodostumista ja sijoittumista, jotka ovat vuorovaikutuksessa kromatiinin kanssa ja kiinnittyvät hermosolujen DNA:n kaksoissidoskatkoksiin[3]?
- Miten nukleoproteiinin CRM1-riippuvainen vienti ja energiariippuvainen mRNA-vienti integroituvat säätelemään poly(A)+ RNA-molekyylien ja poly(A)− genomisen RNA:n osastointia tumakalvon yli[13, 15, 20]?
- Millä molekulaarisella mekanismilla X-proteiini vaimentaa minigenomi-RNA:n kertymistä, ja miten tämä vaimennus risteää polymeraasin kofaktoriaktiivisuuden P-fosforylaatiosta riippuvaisen negatiivisen säätelyn kanssa[15, 23]?
