บทคัดย่อ
Bornaviruses (เช่น Borna disease virus, BDV; Borna disease virus 1, BoDV-1) เป็นไวรัส RNA สายเดี่ยวที่มีฟีโนไทป์แบบ negative-sense และไม่มีการแบ่งส่วน (nonsegmented) ซึ่งลักษณะที่โดดเด่นที่สุดท่ามกลางไวรัส RNA สายลบแบบไม่แบ่งส่วน (NNS-RNA) ในสัตว์คือ การถอดรหัส (transcription) และการจำลองตัว (replication) ของจีโนมเกิดขึ้นภายในนิวเคลียสของเซลล์โฮสต์ แทนที่จะเกิดในไซโทพลาซึมเป็นหลัก [1–3] การศึกษาทางอณูชีววิทยาของ BDV ได้กำหนดจีโนมที่มีขนาดกะทัดรัดประมาณ 8.9–9 kb พร้อมด้วย open reading frames หลายเฟรมที่จัดระเบียบอยู่ในหน่วยการถอดรหัสจำนวนน้อย และขนาบข้างด้วยลำดับปลายสายแบบ extracistronic ที่ทำหน้าที่เป็นโปรโมเตอร์และขอบเขตการควบคุมสำหรับการสังเคราะห์ RNA ของไวรัส [4–8] การแสดงออกของยีนมีความซับซ้อนและรวมถึงการสร้างทั้ง mono- และ polycistronic poly(A)+ RNAs การอ่านทะลุ (readthrough) บ่อยครั้งที่ตำแหน่งสิ้นสุด และการใช้การตัดต่อยีน (splicing) สำหรับการแสดงออกของผลิตภัณฑ์หลัก รวมถึงเอนไซม์โพลีเมอเรส (L) ในบริบทของการถอดรหัสบางอย่าง [4–6, 9, 10] ระบบการสร้างหน้าที่ใหม่ (functional reconstitution) และระบบมินิจีโนม (minigenome) ได้จัดทำแผนที่ความต้องการโปรโมเตอร์แบบ cis-acting ในปลายจีโนมด้าน 3′ และแสดงให้เห็นว่า N และ P ห่อหุ้มเทมเพลตที่จดจำโดยคอมเพล็กซ์โพลีเมอเรส L/P เพื่อสร้างทั้งผลิตภัณฑ์จากการจำลองตัวและการถอดรหัส [11, 12] การจัดระเบียบและการขนส่งภายในนิวเคลียสยังช่วยกำหนดรูปแบบของโปรแกรมการจำลองตัว โดยมี “speckles of transcripts” ของไวรัส (vSPOTs) และการส่งออกนิวคลีโอโปรตีนที่ขึ้นอยู่กับ CRM1 ซึ่งส่งผลต่อพลวัตของ RNP และการแยกส่วนของ viral RNAs แบบ poly(A)+ เทียบกับ poly(A)− [3, 13–15]
คำสำคัญ
- Bornavirus[1]
- Borna disease virus[4]
- nonsegmented negative-strand RNA virus[4]
- nuclear replication[2]
- transcription readthrough[5]
- vSPOTs[3]
- minigenome[11]
- CRM1 export[15]
- phosphoprotein P[15]
- RNA-dependent RNA polymerase L[16]
บทนำ
Bornaviruses เป็นไวรัส NNS-RNA ที่มีลำดับเบสที่เป็นเอกฉันท์ (consensus sequences) ของโปรโมเตอร์และจุดเริ่มต้นของยีนสอดคล้องกับรูปแบบที่พบในวงศ์ต่างๆ ของอันดับ Mononegavirales ซึ่งบ่งชี้ถึงตรรกะการถอดรหัสสายลบที่ใช้ร่วมกันในระดับขององค์ประกอบการเริ่มต้นแบบ cis-acting [4, 17] ความแตกต่างทางกลไกที่สำคัญคือ ในขณะที่ mononegaviruses ส่วนใหญ่จำลองตัวในไซโทพลาซึมเป็นหลัก แต่ bornaviruses กลับจำลองตัวในนิวเคลียส ซึ่งพวกมันได้สร้างตำแหน่งเฉพาะในนิวเคลียสสำหรับการสังเคราะห์ RNA ของไวรัส [1, 3] หลักฐานเชิงทดลองสนับสนุนเป็นพิเศษว่าการจำลองตัวและการถอดรหัสของ BDV เกิดขึ้นในนิวเคลียสของเซลล์ที่ติดเชื้อ และเกี่ยวข้องกับคอมเพล็กซ์ ribonucleoprotein ที่ติดเชื้อได้ (BDV-RNPs) ซึ่งตอกย้ำว่าการสังเคราะห์ RNA ของ bornavirus นั้นดำเนินการในบริบทของ RNP ในนิวเคลียส [4, 13] การระบุตำแหน่งในนิวเคลียสได้รับการสนับสนุนเพิ่มเติมจากการแยกส่วนของเซลล์ (cell fractionation) ซึ่งแสดงให้เห็นว่า BDV RNA ที่มีขั้วจีโนมที่สังเคราะห์ขึ้นใหม่ส่วนใหญ่เป็นแบบ poly(A)− และพบมากในส่วนของนิวเคลียส ซึ่งสอดคล้องกับการจำลองตัวของ RNA จีโนมในนิวเคลียส [13]
โครงสร้างองค์ประกอบจีโนม
การหาลำดับเบสและการทำแผนที่จีโนมของ BDV ระบุว่ามีจีโนมแบบเส้นตรงขนาดประมาณ 8.9 kb โดยมีการทำนายเฟรมการอ่านเปิด (open reading frames) หลักๆ ตลอดจีโนม และขนาบข้างด้วยลำดับที่ไม่รหัส (noncoding sequences) ที่ปลายทั้งสองด้าน [4, 5] ในรายงานฉบับหนึ่ง มีการทำนาย ORF หลัก 5 เฟรม (I–V) ในลำดับจีโนม BDV ขนาด 8,903 nt ในขณะที่คำอธิบายอื่นของจีโนม BDV (8,910 nt) ก็ระบุข้อมูล antisense สำหรับ ORF หลัก 5 เฟรมเช่นเดียวกัน โดยขนาบข้างด้วยลำดับไม่รหัส 53 nt ที่ปลาย 3′ และ 91 nt ที่ปลาย 5′ [4, 5] นอกเหนือจากการกำหนดโครงสร้าง 5-ORF แล้ว การทำแผนที่ในระดับแอนติจีโนมได้อธิบายหน่วยการถอดรหัส 3 หน่วย และ 6 ORF และบทสรุปในระดับการทบทวนวรรณกรรมก็ได้อธิบายว่า BDV รหัส 6 ORF ในหน่วยการถอดรหัส 3 หน่วยที่ขนาบข้างด้วยปลายสายที่เป็นคู่สมกัน ซึ่งทำให้นึกถึงไวรัส NNS RNA ชนิดอื่นๆ [6, 7]
บริเวณรหัสที่ใหญ่ที่สุด (ORF V) รหัสโปรตีนที่ทำนายว่ามีขนาดประมาณ 170 kDa ซึ่งมีความเหมือนอย่างมากกับตระกูลโปรตีน L ของเอนไซม์โพลีเมอเรสในไวรัส NNS-RNA โดยวางตำแหน่ง RNA-dependent RNA polymerase ของไวรัสไว้ที่ปลายด้าน 5′ ของชุดยีนในรูปแบบสายลบตามมาตรฐาน [4] การวิเคราะห์ลำดับที่อนุรักษ์ไว้ระบุถึงความเหมือนสูงสุดในโดเมนที่คาดว่าเป็นโดเมนเร่งปฏิกิริยา (catalytic domain) โดยมีกรดอะมิโนที่ไม่เปลี่ยนแปลงและได้รับการรักษาไว้อย่างเข้มงวดกระจุกตัวอยู่ในโมทีฟ (motif) ที่อนุรักษ์ไว้อย่างสูง 4 ตำแหน่ง (A–D) ซึ่งสอดคล้องกับข้อจำกัดทางเอนไซม์ที่อนุรักษ์ไว้ของการทำงานของโพลีเมอเรสท่ามกลางไวรัส NNS-RNA [18] มีรายงานว่า BDV-RNPs ที่ติดเชื้อบรรจุ RNA ของ BDV เพียงชนิดเดียว คือ RNA ขนาด 9 kb ที่มีขั้วลบและเป็นแบบ poly(A)− ซึ่งสนับสนุนว่า RNA แบบ poly(A)− ความยาวเท่าจีโนมคือชนิดของเทมเพลตที่ถูกห่อหุ้มใน RNP ที่ติดเชื้อ [13]
จีโนมของ Bornavirus ยังมีบริเวณขอบเขตการควบคุมตามปกติของไวรัส NNS-RNA โดยมี ORF ที่ขนาบข้างด้วยลำดับขอบเขตที่ไม่มีการแปลรหัส (nontranslated boundary sequences) ซึ่งรวมถึงสัญญาณการเริ่มต้นและการหยุดการถอดรหัส [8] ลำดับปลายสายสามารถจับคู่เบสเพื่อสร้างโครงสร้างคล้ายด้ามกระทะ (panhandle-like structure) และใน BDV การเรียงตัวของปลายจีโนมทำให้เกิด terminal panhandle โดยมีนิวคลีโอไทด์ 3 ตัวแรกไม่จับคู่กัน ซึ่งเชื่อมโยงความคู่สมของปลายสายเข้ากับสถาปัตยกรรมของโปรโมเตอร์โดยไม่จำเป็นต้องมีการสร้างสายคู่ที่สมบูรณ์แบบ [5] ที่สำคัญ การวิเคราะห์ปลายจีโนมของ BDV รายงานว่าทั้งการขาดความคู่สมของปลายสายที่สมบูรณ์แบบและการเพิ่มขึ้นของความหลากหลายของลำดับปลายสายในระหว่างการติดเชื้อเรื้อรังในระยะยาว บ่งชี้ว่าบริเวณปลายสายแบบ cis-acting นั้นมีความผันแปรแต่ยังคงสามารถทำงานได้ในสถานะการติดเชื้อต่างๆ [11]
เพื่อสรุปสถาปัตยกรรมของจีโนมและการแสดงออกของยีนตามที่อธิบายไว้ในแหล่งข้อมูลเหล่านี้ ตารางด้านล่างได้เปรียบเทียบคุณลักษณะองค์กรที่มักถูกอ้างถึงหลายประการ
การถอดรหัสและการแสดงออกของยีน
การแสดงออกของยีน Bornavirus ใน BDV รวมถึง subgenomic RNAs หลายชนิดที่มีการเติมหาง poly(A) ซึ่งเป็นสายคู่สมกับจีโนมสายลบ โดยมีการศึกษาหนึ่งระบุ subgenomic RNAs ที่มีการเติมหาง poly(A) ถึง 9 ชนิด รวมถึง polycistronic poly(A)+ RNAs 6 ชนิด และ monocistronic mRNAs ที่สอดคล้องกับ ORF I, II และ IV [4] ในการวิเคราะห์เดียวกันนี้ ตรวจไม่พบ monocistronic poly(A)+ RNAs สำหรับ ORF III และ V ซึ่งบ่งชี้ว่าการแสดงออกของบริเวณรหัสบางแห่งไม่ได้ถูกควบคุมโดยข้อความแบบ monocistronic อย่างง่ายใน BDV [4] การวิเคราะห์แบบ Northern ยังแสดงให้เห็นว่า BDV ถอดรหัสทั้ง mono- และ polycistronic RNAs และใช้สัญญาณการสิ้นสุด/การเติมหาง poly(A) ที่ทำให้นึกถึงไวรัส RNA สายลบอื่นๆ ซึ่งสอดคล้องกับโปรแกรมการถอดรหัสแบบหยุด–เริ่ม (stop–start) แต่กระนั้นก็ยังให้ผลเป็นการถอดรหัสที่ต่อเนื่องบ่อยครั้งเกินกว่าตำแหน่งสิ้นสุด [5]
การสิ้นสุดและการเติมหาง poly(A) เกี่ยวข้องกับตำแหน่งที่แยกจากกันและสัญญาณที่จดจำได้ การทดลอง Northern hybridization สนับสนุนการใช้ตำแหน่งสิ้นสุดเฉพาะ (T2, T3, T5 และ T7) และระบุลำดับเบสที่เป็นเอกฉันท์ของสัญญาณการสิ้นสุด/การเติมหาง poly(A) ซึ่งเป็นจุดสังเกตทางโมเลกุลสำหรับขอบเขตการถอดรหัสและแนวโน้มการอ่านทะลุ [5] BDV ยังมีความโดดเด่นในเรื่องความถี่สูงของ transcript ที่เกิดจากการอ่านทะลุเมื่อเทียบกับไวรัส RNA สายลบอื่นๆ ซึ่งนัยว่าประสิทธิภาพการสิ้นสุดถูกปรับจูนอย่างเป็นระบบและอาจมีความสำคัญในเชิงกลไก [5] แท้จริงแล้ว การอ่านทะลุของ T3 มีความจำเป็นต่อการแสดงออกของ p190 (โปรตีนโพลีเมอเรส) ซึ่งเชื่อมโยงการยับยั้งการสิ้นสุดเข้ากับความพร้อมใช้งานของโพลีเมอเรสโดยตรง และด้วยเหตุนี้จึงเชื่อมโยงกับความสามารถในการจำลองตัวและการถอดรหัส [9]
mRNAs ของ BDV มีการเติมโครงสร้าง cap และหาง poly(A) ซึ่งแสดงให้เห็นว่าการบ่มตัวของ mRNA สอดคล้องกับการสร้าง RNA ที่มีความสามารถในการแปลรหัส แม้ว่าจะมีตำแหน่งการจำลองตัวอยู่ในนิวเคลียสก็ตาม [19] ความหลากหลายของรหัสเพิ่มเติมถูกสร้างขึ้นโดยการตัดต่อยีน (splicing) เนื่องจาก RNA ขนาด 2.8 kb และ 7.1 kb ประกอบด้วย intron 2 ตำแหน่งที่ถูกตัดต่อแตกต่างกันเพื่อให้ได้ RNA ที่รหัสผลิตภัณฑ์หลายชนิด รวมถึงโปรตีน G และโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับโพลีเมอเรส และข้อมูลแยกต่างหากระบุว่าการแสดงออกของ L ต้องอาศัยการตัดต่อยีนและการยับยั้งการสิ้นสุด [6, 10] ในระดับของการเริ่มต้นและโครงสร้างโปรโมเตอร์ ความคู่สมของปลายสายที่สมบูรณ์แบบดูเหมือนจะไม่จำเป็นสำหรับกิจกรรมของโปรโมเตอร์ในระดับสูง และความคู่สมของปลายสายที่เพิ่มขึ้นก็ไม่ได้ส่งเสริมการจำลองตัวเทียบกับการถอดรหัสโดยเอนไซม์โพลีเมอเรสของ BDV ซึ่งบ่งชี้ว่าความสมดุลระหว่างการจำลองตัวและการถอดรหัสไม่ใช่หน้าที่ของความแข็งแกร่งในการจับคู่เบสที่ปลายสายเพียงอย่างเดียว [11]
ภาพรวมวงจรการจำลองตัว
การจำลองตัวของ Bornavirus ถูกกำหนดโดยการสังเคราะห์ RNA ในนิวเคลียสและการจัดระเบียบของ RNP ของไวรัสในนิวเคลียส แหล่งข้อมูลหลายแห่งให้หลักฐานว่าการจำลองตัวและการถอดรหัสของ BDV เกิดขึ้นในนิวเคลียสโดยเกี่ยวข้องกับ BDV-RNPs ที่ติดเชื้อ ซึ่งกำหนดให้เทมเพลตที่ทำงานได้สำหรับการสังเคราะห์ RNA คือคอมเพล็กซ์ RNP ที่ทำงานในสภาพแวดล้อมของนิวเคลียส [4, 13] การทดลองแยกส่วนเชิงปริมาณและการติดฉลากแสดงให้เห็นเพิ่มเติมว่า BDV RNA ที่มีขั้วจีโนมที่สังเคราะห์ขึ้นใหม่ส่วนใหญ่เป็นแบบ poly(A)− และอยู่ในนิวเคลียส ซึ่งสนับสนุนข้อสรุปที่ว่าการจำลองตัวของจีโนมเกิดขึ้นในนิวเคลียสของเซลล์ที่ติดเชื้อ [13]
รูปแบบการแยกส่วนที่สอดคล้องกันปรากฏขึ้นสำหรับ RNA ของไวรัสประเภทต่างๆ RNA แบบ poly(A)− ขนาด 9 kb ของ BDV ส่วนใหญ่อยู่ในนิวเคลียส ในขณะที่ poly(A)+ RNAs ที่สังเคราะห์ขึ้นใหม่จะถูกขนส่งไปยังส่วนของไซโทพลาซึม ซึ่งบ่งชี้ว่าการส่งออก mRNA และการกักเก็บจีโนมถูกแยกออกจากกันผ่านเยื่อหุ้มนิวเคลียส [13, 14] การขนส่ง mRNAs ของ BDV ได้รับการพิสูจน์แล้วว่าต้องใช้พลังงาน ซึ่งนัยว่ามีการส่งออกเชิงรุก (active export) แทนที่จะเป็นการแพร่แบบพาสซีฟ (passive diffusion) ซึ่งเป็นจุดควบคุมสำคัญสำหรับการแสดงออกของยีนในการติดเชื้อ bornavirus ในนิวเคลียส [20]
Bornaviruses ยังประกอบโรงงานสร้างไวรัสในนิวเคลียสที่เรียกว่า “viral Speckles Of Transcripts” (vSPOTs) ซึ่งเป็นบริบททางโครงสร้างสำหรับการถอดรหัส/การจำลองตัวที่เข้มข้น และศักยภาพในการประมวลผล RNA ที่มีการประสานงานกันในนิวเคลียส [1] ใน BoDV-1 พบ vSPOTs ที่เกิดจากการแยกชั้นของเหลวและของเหลว (liquid–liquid phase separation) ที่ขับเคลื่อนโดยโปรตีน P ในนิวเคลียส และมีปฏิสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับโครมาติน รวมถึงการเข้าเกาะกับตำแหน่งที่ DNA สายคู่ของเซลล์ประสาทแตกหัก ซึ่งเชื่อมโยงตำแหน่งการจำลองตัวเข้ากับโครงสร้างย่อยของนิวเคลียสที่เฉพาะเจาะจง [3] เพื่อให้สอดคล้องกับความสำคัญของ RNP คอมเพล็กซ์ BDV-RNP ที่บรรจุเพียง RNA ชนิด 9 kb ได้รับรายงานว่ามีกิจกรรมของโพลีเมอเรสที่จำเป็นสำหรับการถอดรหัส และบรรจุข้อมูลทางพันธุกรรมที่จำเป็นในการสั่งการสังเคราะห์โมเลกุลขนาดใหญ่ของ BDV และการผลิตอนุภาค BDV ที่ติดเชื้อ ซึ่งเชื่อมโยง RNP ความยาวเท่าจีโนมเข้ากับขั้นตอนถัดไปในวงจรชีวิตของไวรัส [21]
กลไก RNP และโพลีเมอเรส
RNA ความยาวเท่าจีโนมของ BDV ถูกบรรจุอยู่ในคอมเพล็กซ์ RNP ซึ่งประกอบด้วย N และคอมเพล็กซ์เอนไซม์ RNA-dependent RNA polymerase ของไวรัส ซึ่งกำหนดกลไกหลักเป็นเทมเพลตนิวคลีโอแคปซิดที่ยึดติดกับคอมเพล็กซ์โพลีเมอเรส [15] คอมเพล็กซ์ RdRp ประกอบด้วย P และ L และมีหน้าที่ในการจำลองตัวและการถอดรหัสจีโนมของไวรัส โดยกำหนดให้ L เป็นหน่วยย่อยเร่งปฏิกิริยา และ P เป็นโคแฟกเตอร์โพลีเมอเรสที่จำเป็นใน BDV [15] คำอธิบายทางโครงสร้างและหน้าที่กำหนดเพิ่มเติมว่า L เป็น RdRp ขนาดประมาณ 192 kDa ที่สร้างแกนกลางของคอมเพล็กซ์การจำลองตัว ทำหน้าที่ถอดรหัสและจำลองตัวเพื่อสร้าง mRNA ของไวรัสและสำเนาจีโนมใหม่ และทำงานร่วมกับ P เพื่อการสังเคราะห์ RNA ที่มีประสิทธิภาพ [16]
คุณสมบัติการมีปฏิสัมพันธ์ของโปรตีน P ให้ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับกลไกการทำงานของโพลีเมอเรส P รวมกลุ่มกันเองเป็นโอลิโกเมอร์ผ่านโดเมนการสร้างโอลิโกเมอร์ส่วนกลาง และทำหน้าที่เชื่อมระหว่าง RdRp และนิวคลีโอแคปซิด นอกจากนี้ยังทำหน้าที่เป็นแชเพอโรน (chaperone) ให้กับ N เพื่อรักษาให้อยู่ในรูปแบบที่ไม่มี RNA ซึ่งจำเป็นสำหรับการจำลองตัว สนับสนุนแบบจำลองที่ P ประสานงานทั้งการดึงดูดเอนไซม์และความพร้อมของเทมเพลต [3] เพื่อให้สอดคล้องกัน การขัดขวางการสร้างโอลิโกเมอร์ของ P ในการทดสอบ minireplicon ได้ตรวจสอบว่ามิวแทนท์ของ P ที่มีความบกพร่องในการสร้างโอลิโกเมอร์สามารถสร้างคอมเพล็กซ์โพลีเมอเรสที่ทำงานได้หรือไม่ และพบว่าไม่มีมิวแทนท์ของ P ตัวใดที่สนับสนุนการแสดงออกของยีนรายงานผล ซึ่งบ่งชี้ว่าการสร้างโอลิโกเมอร์ของ P เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับกิจกรรมของโพลีเมอเรสภายใต้สภาวะเหล่านี้ [22] นอกจากนี้ กิจกรรมโคแฟกเตอร์ของ P สำหรับ RdRp ของ BDV ยังถูกควบคุมในเชิงลบโดยกระบวนการฟอสโฟรีเลชัน ซึ่งเป็นกลไกการควบคุมหลังการแปลรหัสที่ชัดเจนสำหรับการทำงานของเอนไซม์โพลีเมอเรส [15]
ไอโซฟอร์มของนิวคลีโอโปรตีน Bornavirus ยังเชื่อมโยงการทำงานของโปรตีนกับการระบุตำแหน่งภายในเซลล์ การทดลองที่แสดงออก p40 และ p38 แสดงให้เห็นว่า p40 ส่วนใหญ่อยู่ในนิวเคลียส ในขณะที่ p38 ส่วนใหญ่อยู่ในไซโทพลาซึม แต่ทั้งคู่ต่างก็จับกับฟอสโฟโปรตีน P ของ BDV ซึ่งบ่งชี้ว่าการระบุตำแหน่งที่ขึ้นอยู่กับไอโซฟอร์มควบคู่ไปกับการจับกับ P อาจปรับเปลี่ยนตำแหน่งที่การประกอบ RNP และ/หรือการทำงานของมันเกิดขึ้น [9] เพื่อให้สอดคล้องกับบทบาทในการกำหนดเป้าหมายไปที่นิวเคลียสของ P พบว่า P มีสัญญาณระบุตำแหน่งในนิวเคลียส (NLS) แบบ bipartite ที่แข็งแกร่งที่ปลายอะมิโน และโมทีฟ NLS ที่อ่อนแอกว่าเพิ่มเติม สนับสนุนว่าการนำเข้าคอมเพล็กซ์ที่มีโพลีเมอเรสเข้าสู่นิวเคลียสเป็นข้อกำหนดเบื้องต้นทางกลไกสำหรับการสังเคราะห์ RNA ในนิวเคลียส [9]
ในที่สุด โปรตีนเสริม X สามารถลดระดับการสังเคราะห์ RNA ได้โดยตรงในระบบที่สร้างขึ้นใหม่ เมื่อคอมเพล็กซ์โพลีเมอเรสของ BDV ถูกสร้างขึ้นใหม่ในเซลล์ที่แสดงออกโปรตีน X ตรวจไม่พบ plus-strand minigenome RNA ซึ่งบ่งชี้ว่า X ยับยั้งทั้งการถอดรหัสและการจำลองตัวของไวรัสในบริบทการทดสอบนั้น [23] ข้อสังเกตเหล่านี้รวมกันสนับสนุนแบบจำลองกลไกที่ L และ P ก่อตัวเป็นแกนกลางเร่งปฏิกิริยา การสร้างโอลิโกเมอร์และฟอสโฟรีเลชันของ P ควบคุมความสามารถของโพลีเมอเรส และปัจจัยเสริม เช่น X สามารถยับยั้งผลผลิตของโพลีเมอเรสภายใต้สภาวะที่กำหนด [15, 23]
การขนส่งภายในนิวเคลียส
Bornaviruses เชื่อมโยงการจำลองตัวในนิวเคลียสเข้ากับการขนส่งส่วนประกอบ RNP และชนิดของ RNA ระหว่างนิวเคลียสและไซโทพลาซึม (nucleocytoplasmic trafficking) ที่มีการควบคุม หลักฐานโดยตรงบ่งชี้ว่าการจำลองตัวและการถอดรหัสของ BDV เกิดขึ้นในนิวเคลียสที่มี BDV RNPs ที่ติดเชื้ออยู่ และการแยกส่วนบ่งชี้ว่า RNA ที่มีขั้วจีโนมที่สังเคราะห์ขึ้นใหม่นั้นมีความเข้มข้นสูงในส่วนของนิวเคลียส ซึ่งเป็นแรงผลักดันเชิงหน้าที่สำหรับเส้นทางการนำเข้าและส่งออกของนิวเคลียสในการประสานงานวงจรชีวิต [13, 21] การทดสอบการขนส่ง RNA บ่งชี้ว่า poly(A)+ RNAs ของ BDV ที่สังเคราะห์ขึ้นใหม่จะถูกขนส่งไปยังส่วนของไซโทพลาซึมอย่างมีประสิทธิภาพ ในขณะที่ genomic RNA ขนาด 9 kb ยังคงอยู่ในนิวเคลียสเป็นส่วนใหญ่ ซึ่งแสดงให้เห็นถึงพฤติกรรมการส่งออกที่จำเพาะตามประเภทของ RNA [14] ยิ่งไปกว่านั้น การขนส่ง mRNA ยังต้องใช้พลังงาน โดยมีการส่งออกเพียงเล็กน้อยเมื่อไม่มี ATP ซึ่งสนับสนุนกลไกการส่งออกเชิงรุกที่ขึ้นกับปัจจัยของโฮสต์สำหรับ mRNAs ของไวรัส [20]
สำหรับการขนส่งโปรตีน การส่งออกที่ขึ้นกับ CRM1 มีส่วนเกี่ยวข้องกับนิวคลีโอโปรตีน การส่งออกนิวเคลียสของ N เป็นไปตามเส้นทางที่ขึ้นกับ CRM1 ซึ่งสอดคล้องกับ NES และข้อมูลแยกต่างหากก็รายงานในทำนองเดียวกันว่าการส่งออกนิวเคลียสของ BoDV-N เกิดขึ้นผ่านเส้นทางที่ขึ้นกับ CRM1 ซึ่งบ่งชี้ถึงการอนุรักษ์เส้นทางการส่งออกนี้ภายใน bornaviruses [15, 24] การทบทวนในวงกว้างยังระบุว่าโปรตีนของ BDV หลายชนิด (รวมถึงนิวคลีโอโปรตีน, ฟอสโฟโปรตีน, X และ L) มีส่วนช่วยในการขนส่ง BDV RNP ระหว่างนิวเคลียสและไซโทพลาซึม และการควบคุมทิศทางน่าจะถูกกำหนดโดยอัตราส่วนและปฏิสัมพันธ์ระหว่างองค์ประกอบ NLS และ NES ใน RNP ซึ่งกำหนดกรอบการขนส่งว่าเป็นคุณสมบัติที่เกิดขึ้นจากการแข่งขันของสัญญาณระบุตำแหน่ง แทนที่จะเป็นปัจจัยกำหนดเพียงอย่างเดียว [25]
การก่อตัวของโรงงานสร้างไวรัสในนิวเคลียสเป็นระดับการจัดการอีกระดับที่เกี่ยวข้องกับการขนส่ง Bornaviruses ประกอบ vSPOTs ในนิวเคลียส และ vSPOTs ของ BoDV-1 เกิดจากการแยกชั้นของเหลวและของเหลวที่ขับเคลื่อนโดยโปรตีน P และมีปฏิสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับโครมาติน ซึ่งสามารถจำกัดการแพร่กระจายและอาจกำหนดตำแหน่งของตำแหน่งการถอดรหัส/การจำลองตัวเทียบกับจุดสังเกตในนิวเคลียสของโฮสต์ [1, 3]
พันธุศาสตร์ย้อนกลับและองค์ประกอบโปรโมเตอร์
สัญญาณควบคุมแบบ cis-acting ของ Bornavirus กระุกตัวอยู่ในบริเวณรอยต่อที่ไม่มีการแปลรหัสและบริเวณปลายสาย ใน BDV นั้น ORF จะถูกขนาบข้างด้วยลำดับขอบเขตที่ไม่มีการแปลรหัสซึ่งบรรจุสัญญาณควบคุมสำหรับการเริ่มต้นและการหยุดการถอดรหัส ซึ่งสอดคล้องกับสถาปัตยกรรมที่คล้ายกับ Mononegavirales ของสัญญาณ gene-start และ gene-end ที่ชี้นำพฤติกรรมของโพลีเมอเรสตลอดจีโนม [8] ลำดับเบสที่เป็นเอกฉันท์ของจุดเริ่มต้น BDV ที่สรุปได้ (UNCNNNUUNN) นั้นเหมือนกับลำดับที่อนุมานจากการเปรียบเทียบไวรัส NNS-RNA ในวงศ์ต่างๆ ของ Mononegavirales ซึ่งสนับสนุนการอนุรักษ์โมทีฟการเริ่มต้นที่ใช้โดยกลไกโพลีเมอเรส [4, 17] สัญญาณการสิ้นสุด/การเติมหาง poly(A) รวมถึงโมทีฟ 6 ตัว (six-mer) AUUUUU ที่อนุรักษ์ไว้ที่ปลาย 5′ ของแต่ละสัญญาณ ตามด้วย GG (หรือ CG ใน ORF II) ในขณะที่สัญญาณที่คาดว่าจะเป็นสัญญาณสำหรับ ORF III ไม่สามารถระบุได้ในการวิเคราะห์หนึ่ง ซึ่งบ่งชี้ถึงทั้งการอนุรักษ์และช่องว่างในการตรวจหาโมทีฟข้ามขอบเขตของยีน [4]
แนวทางพันธุศาสตร์ย้อนกลับ (reverse-genetics) และมินิจีโนมได้ทดสอบองค์ประกอบควบคุมเหล่านี้โดยตรง ระบบ RNA polymerase I/polymerase II ถูกจัดทำขึ้นเพื่อการสร้างการจำลองตัวและการถอดรหัส RNA ของ BDV ใหม่ภายในเซลล์ ทำให้สามารถวิเคราะห์ความต้องการแบบ cis- และ trans-acting ได้อย่างควบคุม [11] ในระบบนี้ อะนาล็อกของ RNA ของ BDV (minigenome) จะถูกสังเคราะห์โดยเอนไซม์ RNA polymerase I ของเซลล์ และบรรจุลำดับ cis-acting ที่ไม่แปลรหัส 5′ และ 3′ ของ BDV ที่จำเป็นสำหรับการสังเคราะห์ RNA ที่ดำเนินการโดยเอนไซม์โพลีเมอเรสของ BDV ซึ่งเชื่อมโยงบริเวณปลายสายเข้ากับการทำงานของโปรโมเตอร์ในเซลล์ [11] การห่อหุ้ม minigenome RNA ที่ได้จาก polymerase I ด้วย BDV N และ P ที่ได้รับจากพลาสมิด จะสร้างเทมเพลตที่จดจำโดยโพลีเมอเรสของ BDV ที่สร้างขึ้นใหม่ เพื่อสั่งการสังเคราะห์ antiminigenome RNA ที่มีความยาวเต็ม (การจำลองตัว) และ subgenomic mRNA ที่รหัสยีนรายงานผล ซึ่งเป็นการพิสูจน์เชิงทดลองว่าการห่อหุ้มด้วย N และ P นั้นเพียงพอที่จะทำให้ RNA มีความสามารถในการถูกจดจำโดยโพลีเมอเรสและการสังเคราะห์ RNA แบบสองผลลัพธ์ [11]
การทำแผนที่โปรโมเตอร์ช่วยปรับปรุงแบบจำลอง cis-acting ให้ละเอียดยิ่งขึ้น ลำดับต้นน้ำ (นิวคลีโอไทด์ 25 ถึง 33) จำเป็นสำหรับกิจกรรมโปรโมเตอร์ที่เหมาะสม และการลบนิวคลีโอไทด์ 34 ถึง 35 ทำให้กิจกรรมของยีนรายงานผลเป็นโมฆะในบริบทนี้ โดยระบุถึงความต้องการลำดับใกล้โปรโมเตอร์ที่สั้นและเฉพาะตำแหน่งในบริเวณโปรโมเตอร์จีโนมด้าน 3′ [12] ข้อมูลเหล่านี้รวมกันสนับสนุนสถาปัตยกรรมของโปรโมเตอร์ที่ลำดับปลายสายที่กะทัดรัดและองค์ประกอบต้นน้ำที่อยู่ใกล้เคียงควบคุมการเริ่มต้นและการจำลองตัว/การถอดรหัสที่มีประสิทธิภาพในระบบโพลีเมอเรสที่สร้างขึ้นใหม่ [11, 12]
กลไกการติดเชื้อแบบเรื้อรัง
การติดเชื้อแบบเรื้อรังในระดับโมเลกุลของ Bornavirus เชื่อมโยงกับพลวัตของส่วนปลายจีโนม การจำลองตัวในนิวเคลียส และการจัดระเบียบในนิวเคลียสที่เฉพาะเจาะจง กระบวนการ “realign-and-elongation” จะสร้างปลาย 3′ ของโมเลกุล v- และ cRNA ขึ้นใหม่จากเทมเพลตภายในในแต่ละรอบของการจำลองตัว และจะเกิดขึ้นได้ก็ต่อเมื่อส่วนปลายนั้นสมบูรณ์เท่านั้น ซึ่งเป็นขั้นตอนทางกลไกที่ชัดเจนที่ทำหน้าที่เป็นจุดตรวจควบคุมคุณภาพสำหรับความสมบูรณ์ของจีโนม [26] กระบวนการนี้ให้การควบคุมคุณภาพแบบบูรณาการที่ยับยั้งการจำลองตัวของโมเลกุล RNA ที่มีการลบส่วนปลาย เชื่อมโยงตรรกะการซ่อมแซมส่วนปลายเข้ากับการคัดเลือกต่อต้านตัวกลางการจำลองตัวที่บกพร่อง [26] ในขณะเดียวกัน การวิเคราะห์ปลายจีโนมในระหว่างการติดเชื้อเรื้อรังในระยะยาวรายงานว่ามีความหลากหลายของปลายสายในระดับที่สูงขึ้นใน RNA จากเซลล์ที่ติดเชื้อเรื้อรังเมื่อเทียบกับจุดเวลาที่ติดเชื้อเฉียบพลัน บ่งชี้ว่าการติดเชื้อแบบเรื้อรังมาพร้อมกับการเปลี่ยนแปลงในการกระจายตัวของตัวแปรส่วนปลายจีโนม [11]
การติดเชื้อแบบเรื้อรังยังเกี่ยวข้องกับบริบทในนิวเคลียสที่เสถียรสำหรับ RNP Bornaviruses ได้รับการอธิบายว่าเป็นหนึ่งเดียวในบรรดาไวรัส NNS RNA ในสัตว์ที่รู้จัก ที่จำลองตัวและถอดรหัสในนิวเคลียส ซึ่งเป็นสภาพแวดล้อมการแยกส่วนของเซลล์สำหรับการสังเคราะห์ RNA ที่ไม่ทำลายเซลล์ในระยะยาว และการประมวลผลปลายจีโนมในนิวเคลียส [2] นอกจากนี้ BoDV-1 ยังสร้าง vRNPs ของมันโดยใช้โครมาตินของโฮสต์เป็นโครงนั่งร้าน (scaffold) ซึ่งเป็นคุณสมบัติที่สามารถสนับสนุนการติดเชื้อแบบเรื้อรังในนิวเคลียสในเชิงกลไกโดยการทำให้ตำแหน่งของ vRNP เสถียรเมื่อเทียบกับโครมาติน [27]
การปรับเปลี่ยนการตอบสนองของโฮสต์ยังได้รับการเชื่อมโยงเชิงทดลองกับสถานะการติดเชื้อ เซลล์ที่ติดเชื้อ BDV หลั่ง SEAP น้อยกว่าเซลล์ควบคุมหลังจากเปิดใช้งานด้วย Pam3CSK4 ซึ่งบ่งชี้ว่าเซลล์ที่ติดเชื้อ BDV ยับยั้งการส่งสัญญาณ NF-κB อย่างแข็งขัน ซึ่งเป็นความสัมพันธ์ในระดับโมเลกุลสำหรับการส่งสัญญาณภูมิคุ้มกันตามธรรมชาติที่เปลี่ยนแปลงไปในระหว่างการติดเชื้อเรื้อรัง [28]
คำถามที่ยังไม่มีคำตอบ
คำถามระดับโมเลกุลหลายประการยังคงไม่มีคำตอบ หรืออยู่ในตำแหน่งที่พร้อมสำหรับการทดลองเป้าหมายตามผลการวิจัยทางกลไกที่สรุปไว้ข้างต้น
- ลำดับเบสและปัจจัยกำหนดโครงสร้างใดที่ควบคุมประสิทธิภาพการสิ้นสุดของ BDV และความถี่สูงของ transcript ที่เกิดจากการอ่านทะลุ โดยเฉพาะที่ T3 ซึ่งการอ่านทะลุมีความจำเป็นต่อการแสดงออกของโพลีเมอเรส [5, 9]
- เหตุการณ์การตัดต่อยีนทางเลือกใน RNA ขนาด 2.8 kb และ 7.1 kb มีปฏิสัมพันธ์กับการใช้ขอบเขตการถอดรหัสอย่างไร เพื่อให้ได้ปริมาณสารสัมพันธ์ (stoichiometries) ที่ถูกต้องของผลิตภัณฑ์ G และโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับโพลีเมอเรส รวมถึงในกรณีที่การแสดงออกของ L ต้องอาศัยการตัดต่อยีนและการยับยั้งการสิ้นสุด [6, 10]
- ความสัมพันธ์เชิงปริมาณระหว่างความหลากหลายของปลายสายที่พบในระหว่างการติดเชื้อเรื้อรังและกิจกรรมของโปรโมเตอร์คืออะไร ในเมื่อความคู่สมของปลายสายที่สมบูรณ์แบบไม่จำเป็นสำหรับกิจกรรมโปรโมเตอร์ในระดับสูง และปลายสายมีความหลากหลายมากขึ้นในระหว่างการติดเชื้อระยะยาว [11]
- ขั้นตอนการควบคุมคุณภาพ realign-and-elongation ประสานงานกับการจัดระเบียบ RNP ในนิวเคลียสอย่างไร ในเมื่อการสร้างปลาย 3′ ขึ้นใหม่ได้มาจากเทมเพลตภายในและยับยั้งการจำลองตัวของ RNA ที่ถูกลบปลายสาย [26]
- ปัจจัยของโฮสต์และจุดสังเกตในนิวเคลียสใดที่ควบคุมการก่อตัวและตำแหน่งของ vSPOTs ที่แยกชั้นซึ่งขับเคลื่อนโดย P ซึ่งมีปฏิสัมพันธ์กับโครมาตินและเกาะติดกับตำแหน่ง DNA สายคู่ที่แตกหักของเซลล์ประสาท [3]
- การส่งออกนิวคลีโอโปรตีนที่ขึ้นกับ CRM1 และการส่งออก mRNA ที่ต้องใช้พลังงานรวมเข้าด้วยกันอย่างไรเพื่อควบคุมการแยกส่วนของ poly(A)+ RNAs เทียบกับ poly(A)− genomic RNA ผ่านเยื่อหุ้มนิวเคลียส [13, 15, 20]
- กลไกทางโมเลกุลใดที่โปรตีน X ใช้ในการยับยั้งการสะสมของ minigenome RNA และการยับยั้งนี้ตัดกับข้อบังคับเชิงลบของกิจกรรมโคแฟกเตอร์โพลีเมอเรสที่ขึ้นกับฟอสโฟรีเลชันของ P อย่างไร [15, 23]
