Bornavirusurile: Organizarea Genomului, Replicarea Nucleară și Mecanismele de Expresie Genică

Rezumat

Bornavirusurile (de exemplu, virusul bolii Borna, BDV; virusul bolii Borna 1, BoDV-1) sunt virusuri ARN monocatenare nesegmentate cu sens negativ, a căror caracteristică cea mai distinctivă printre virusurile ARN cu catenă negativă nesegmentată (NNS-RNA) animale este faptul că transcrierea și replicarea genomului au loc în nucleul celulei gazdă mai degrabă decât predominant în citoplasmă[1–3]. Studiile moleculare ale BDV au definit un genom compact de ~8.9–9 kb cu multiple cadre deschise de citire organizate într-un număr mic de unități de transcriere și flancate de secvențe terminale extracistronice care funcționează ca promotori și limite reglatoare pentru sinteza ARN-ului viral[4–8]. Expresia genică este complexă și include producția de ARN-uri poly(A)+ atât mono- cât și policistronice, readthrough frecvent la siturile de terminare și utilizarea splicing-ului pentru exprimarea produselor cheie, inclusiv polimeraza (L) în unele contexte de transcriere[4–6, 9, 10]. Sistemele de reconstituire funcțională și de minigenom au cartografiat cerințele promotorului cu acțiune cis în capătul genomic 3′ și au arătat că N și P încapsidează template-uri recunoscute de complexul polimerazic L/P pentru a genera atât produse replicative, cât și de transcriere[11, 12]. Organizarea și traficul nuclear modelează în continuare programul de replicare, „speckles de transcrieri” virale (vSPOTs) și exportul nucleoproteinei dependent de CRM1 contribuind la dinamica RNP și la compartimentarea ARN-urilor virale poly(A)+ versus poly(A)−[3, 13–15].

Cuvinte cheie

• Bornavirus[1]
• Borna disease virus[4]
• virus ARN cu catenă negativă nesegmentată[4]
• replicare nucleară[2]
• readthrough de transcriere[5]
• vSPOTs[3]
• minigenom[11]
• export CRM1[15]
• fosfoproteina P[15]
• ARN-dependentă ARN-polimeraza L[16]

Introducere

Bornavirusurile sunt virusuri NNS-RNA ale căror secvențe consens de promotor și de start al genei se aliniază cu modelele observate în familiile Mononegavirales, indicând o logică comună de transcriere a catenei negative la nivelul elementelor de inițiere cu acțiune cis[4, 17]. O distincție mecanică centrală este aceea că, în timp ce majoritatea mononegavirusurilor se replică în principal în citoplasmă, bornavirusurile se replică în nucleu, unde stabilesc situri nucleare specializate pentru sinteza ARN-ului viral[1, 3]. Dovezile experimentale susțin în mod specific faptul că replicarea și transcrierea BDV au loc în nucleii celulelor infectate și sunt asociate cu complexe ribonucleoproteice infecțioase (BDV-RNPs), subliniind faptul că sinteza ARN-ului bornaviral este executată în contextul RNP-urilor nucleare[4, 13]. Localizarea nucleară este susținută în continuare de fracționarea celulară, care arată că cea mai mare parte a ARN-ului BDV de polaritate genomică nou sintetizat este poly(A)− și se găsește în mare parte în fracțiunea nucleară, în concordanță cu replicarea nucleară a ARN-ului genomic[13].

Organizarea genomului

Secvențierea și cartografierea genomului BDV au identificat un genom liniar de ~8.9 kb cu cadre deschise de citire majore prezise de-a lungul genomului și flancate de secvențe necodificatoare la ambele terminale[4, 5]. Într-un raport, cinci ORF-uri majore (I–V) au fost prezise într-o secvență de genom BDV de 8,903-nt, în timp ce o altă descriere a genomului BDV (8,910 nt) a menționat în mod similar informații antisens pentru cinci ORF-uri majore flancate de 53 nt de secvență necodificatoare la terminalul 3′ și 91 nt la terminalul 5′[4, 5]. Pe lângă încadrarea cu cinci ORF-uri, cartografierea la nivel de antigenom a descris trei unități de transcriere și șase ORF-uri, iar rezumatele de tip review descriu, de asemenea, BDV ca codificând șase ORF-uri în trei unități de transcriere încadrate de terminale complementare ce amintesc de alte virusuri NNS RNA[6, 7].

Cea mai mare regiune codificatoare (ORF V) codifică o proteină prezisă de ~170 kDa cu o puternică omologie cu familia de proteine L a polimerazelor virusurilor NNS-RNA, plasând ARN-polimeraza ARN-dependentă virală la capătul 5′-proximal al setului de gene în dispunerea canonică a catenei negative[4]. Analiza secvențelor conservate a identificat cea mai mare omologie într-un domeniu catalitic putativ cu reziduuri invariante și menținute conservator grupate în patru motive înalt conservate (A–D), în concordanță cu constrângerile enzimatice conservate asupra funcției polimerazei printre virusurile NNS-RNA[18]. S-a raportat că BDV-RNP-urile infecțioase conțin o singură specie de ARN BDV, ARN-ul de 9-kb cu polaritate negativă și poly(A)−, susținând faptul că ARN-ul poly(A)− de lungime genomică este specia de template încapsidată în RNP-urile infecțioase[13].

Genomurile de bornavirus poartă, de asemenea, regiuni reglatoare de frontieră tipice virusurilor NNS-RNA, cu ORF-uri flancate de secvențe de frontieră netranslatate care includ semnale de inițiere și oprire a transcrierii[8]. Secvențele terminale se pot împerechea prin baze pentru a forma o structură asemănătoare unui mâner de tigaie (panhandle), iar în BDV alinierea terminalelor genomice a permis formarea unui panhandle terminal cu primele 3 nucleotide neîmperecheate, legând complementaritatea terminală de arhitectura promotorului fără a necesita o duplexare perfectă[5]. Important, analizele terminalelor genomice ale BDV au raportat atât lipsa complementarității terminale perfecte, cât și o eterogenitate crescută a secvenței terminale în timpul persistenței pe termen lung, indicând faptul că regiunile terminale cu acțiune cis sunt variabile, dar tolerate funcțional în diferite stări de infecție[11].

Pentru a rezuma concis arhitectura genomului și a expresiei genice, așa cum este descrisă în aceste surse, tabelul de mai jos compară câteva caracteristici organizaționale frecvent citate.

Transcrierea și expresia genică

Expresia genică a bornavirusului în BDV include multiple ARN-uri subgenomice poliadenilate complementare genomului cu sens negativ, un studiu identificând nouă specii de ARN-uri subgenomice poliadenilate, inclusiv șase ARN-uri poly(A)+ policistronice și ARNm-uri monocistronice corespunzătoare ORF-urilor I, II și IV[4]. În aceeași analiză, ARN-urile poly(A)+ monocistronice pentru ORF-urile III și V nu au fost detectate, indicând faptul că exprimarea unor regiuni codificatoare nu este dominată de mesaje monocistronice simple în BDV[4]. Analizele Northern au arătat, de asemenea, că BDV transcrie atât ARN-uri mono- cât și policistronice și utilizează semnale de terminare/poliadenilare ce amintesc de alte virusuri ARN cu catenă negativă, în concordanță cu un program transcripțional stop–start care produce totuși o continuitate frecventă a transcrierii dincolo de siturile de terminare[5].

Terminarea și poliadenilarea implică situri discrete și un semnal recognoscibil. Experimentele de hibridizare Northern au susținut utilizarea unor situri de terminare specifice (T2, T3, T5 și T7) și au identificat o secvență consens a semnalului de terminare/poliadenilare, oferind repere moleculare pentru limitele transcrierii și propensiunea pentru readthrough[5]. BDV este, de asemenea, notabil pentru o frecvență ridicată a transcrierilor readthrough comparativ cu alte virusuri ARN cu catenă negativă, implicând faptul că eficiența terminării este reglată sistematic și poate fi esențială din punct de vedere mecanic[5]. Într-adevăr, readthrough-ul T3 este esențial pentru exprimarea p190 (proteina polimerazei), legând direct suprimarea terminării de disponibilitatea polimerazei și, astfel, de capacitatea de replicare și transcriere[9].

ARNm-urile BDV sunt capate și poliadenilate, demonstrând că maturarea ARNm este consistentă cu producerea de ARN-uri competente pentru translație în ciuda nișei de replicare nucleară[19]. Diversitatea codificatoare suplimentară este generată prin splicing, deoarece ARN-urile de 2.8-kb și 7.1-kb conțin doi introni care sunt matisați diferențiat pentru a genera ARN-uri care codifică multiple produse inclusiv proteine G și proteine corelate cu polimeraza, iar declarații separate indică faptul că expresia L necesită splicing și suprimarea terminării[6, 10]. La nivelul inițierii și al structurii promotorului, complementaritatea terminală perfectă nu pare a fi necesară pentru o activitate ridicată a promotorului, iar complementaritatea terminală crescută nu a promovat replicarea față de transcriere de către polimeraza BDV, indicând faptul că echilibrul replicare–transcriere nu este pur și simplu o funcție a forței de împerechere a bazelor terminale[11].

Prezentare generală a ciclului de replicare

Replicarea bornavirusului este definită prin sinteza ARN-ului nuclear și organizarea nucleară a RNP-urilor virale. Surse multiple oferă dovezi că replicarea și transcrierea BDV au loc în nucleu în asociere cu BDV-RNP-uri infecțioase, stabilind că template-ul funcțional pentru sinteza ARN este un complex RNP care operează în mediul nuclear[4, 13]. Experimentele cantitative de fracționare și marcare au arătat în continuare că majoritatea ARN-ului BDV cu polaritate genomică nou sintetizat este poly(A)− și nuclear, susținând concluzia că replicarea genomului are loc în nucleul celulelor infectate[13].

Apare un model de compartimentare consistent pentru diferite clase de ARN viral. ARN-ul BDV de 9-kb poly(A)− este în mare parte nuclear, în timp ce ARN-urile poly(A)+ nou sintetizate sunt transportate în compartimentul citoplasmatic, indicând faptul că exportul ARNm și retenția genomului sunt separate prin învelișul nuclear[13, 14]. S-a demonstrat că transportul ARNm-urilor BDV este dependent de energie, implicând un export activ mai degrabă decât difuzia pasivă ca punct cheie de control pentru expresia genică în infecția cu bornavirus nuclear[20].

Bornavirusurile asamblează, de asemenea, fabrici virale nucleare descrise ca „Speckles Of Transcripts” virale (vSPOTs), oferind un context structural pentru transcrierea/replicarea concentrată și procesarea ARN-ului potențial coordonată în nucleu[1]. În BoDV-1, vSPOTs formate prin separarea de fază lichid-lichid condusă de proteina P sunt prezente în nucleu și interacționează strâns cu cromatina, inclusiv andocarea la rupturile de dublă catenă ale ADN-ului neuronal, legând siturile de replicare de substructuri nucleare specifice[3]. În concordanță cu centralitatea RNP-urilor, s-a raportat că complexele BDV-RNP care conțin doar specia de ARN de 9-kb posedă activitatea polimerazică necesară pentru transcriere și transportă informația genetică necesară pentru a direcționa sinteza macromoleculelor BDV și producerea de particule BDV infecțioase, conectând RNP-urile de lungime genomică de etapele ulterioare ale ciclului de viață viral[21].

Mașinăria RNP și a polimerazei

ARN-ul de lungime genomică al BDV este ambalat în complexe RNP care conțin N și complexul ARN-polimerazei ARN-dependente virale, definind mașinăria centrală ca un template de nucleocapsidă legat de complexul polimerazic[15]. Complexul RdRp constă din P și L și este responsabil pentru replicarea și transcrierea genomului viral, stabilind L ca subunitate catalitică și P ca cofactor polimerazic esențial în BDV[15]. Descrierile structurale și funcționale definesc în continuare L ca o RdRp de ~192 kDa care formează nucleul complexului de replicare, efectuând transcrierea și replicarea pentru a produce ARNm viral și noi copii ale genomului, și asociindu-se cu P pentru sinteza eficientă a ARN-ului[16].

Proprietățile de interacțiune proteică ale P oferă o perspectivă mecanică asupra funcției polimerazei. P se autoasociază în oligomeri printr-un domeniu de oligomerizare central și face legătura între RdRp și nucleocapsidă, și, de asemenea, acționează ca chaperon pentru N pentru a o menține într-o formă fără ARN necesară pentru replicare, susținând un model în care P coordonează atât recrutarea enzimei cât și disponibilitatea template-ului[3]. În mod constant, perturbarea experimentală a oligomerizării P într-un eseu de minireplicon a abordat dacă mutanții P defecți în oligomerizare ar putea reconstitui complexe polimerazice funcționale, și niciunul dintre mutanții P nu a susținut expresia genei raportoare, indicând faptul că oligomerizarea P este necesară pentru activitatea polimerazei în aceste condiții[22]. În plus, activitatea de cofactor a P pentru RdRp a BDV este reglată negativ prin fosforilare, oferind o pârghie de reglare post-translațională explicită pentru funcția polimerazei[15].

Izoformele nucleoproteinei bornavirusului conectează, de asemenea, funcția proteinei de localizarea intracelulară. Experimentele care au exprimat p40 și p38 au arătat că p40 este în principal nucleară, în timp ce p38 este în principal citoplasmatică, totuși ambele leagă fosfoproteina P a BDV, sugerând că localizarea dependentă de izoformă cuplată cu legarea P poate modula locul în care are loc asamblarea și/sau funcția RNP[9]. În concordanță cu un rol de țintire nucleară pentru P, P conține un semnal de localizare nucleară (NLS) bipartit puternic la amino-terminal și motive NLS suplimentare mai slabe, susținând importul nuclear al complexelor care conțin polimerază ca o condiție prealabilă mecanică pentru sinteza ARN-ului nuclear[9].

În cele din urmă, proteina accesorie X poate reduce direct sinteza ARN-ului în sistemele reconstituite. Când complexele polimerazice BDV au fost reconstituite în celule care exprimă proteina X, nu a fost detectat niciun ARN de minigenom cu catenă plus, sugerând că X inhibă atât transcrierea, cât și replicarea virală în acel context de eseu[23]. Aceste observații susțin împreună un model de mașinărie în care L și P formează nucleul catalitic, oligomerizarea și fosforilarea P reglează competența polimerazei, iar factorii accesorii precum X pot suprima rezultatul polimerazei în condiții definite[15, 23].

Traficul nuclear

Bornavirusurile cuplează replicarea nucleară cu traficul nucleocitoplasmatic reglat al componentelor RNP și al speciilor de ARN. Dovezile directe indică faptul că replicarea și transcrierea BDV au loc în nuclei unde sunt prezente RNP-uri BDV infecțioase, iar fracționarea indică faptul că ARN-ul de polaritate genomică nou sintetizat este puternic îmbogățit în fracțiunea nucleară, oferind un impuls funcțional pentru ca căile de import și export nuclear să coordoneze ciclul de viață[13, 21]. Eseurile de transport al ARN-ului indică faptul că ARN-urile poly(A)+ BDV nou sintetizate sunt transportate eficient în compartimentul citoplasmatic în timp ce ARN-ul genomic de 9-kb rămâne în mare parte nuclear, demonstrând un comportament de export specific clasei de ARN[14]. Mai mult, transportul ARNm este dependent de energie, cu un export neglijabil în absența ATP, susținând mecanisme de export active, dependente de factorii gazdă, pentru ARNm-urile virale[20].

Pentru traficul de proteine, exportul dependent de CRM1 este implicat pentru nucleoproteină. Exportul nuclear al N se face printr-o cale dependentă de CRM1 consistentă cu un NES, iar o declarație separată raportează în mod similar că exportul nuclear al BoDV-N are loc printr-o cale dependentă de CRM1, indicând conservarea acestei rute de export în cadrul bornavirusurilor[15, 24]. Review-uri mai largi afirmă în continuare că mai multe proteine BDV (inclusiv nucleoproteina, fosfoproteina, X și L) contribuie la traficul nucleocitoplasmatic al RNP-ului BDV și că controlul direcțional este probabil determinat de rapoartele și interacțiunile dintre elementele NLS și NES din RNP, încadrând traficul ca o proprietate emergentă a semnalelor de localizare concurente mai degrabă decât ca un singur determinant[25].

Formarea fabricii virale nucleare oferă un nivel organizațional suplimentar relevant pentru trafic. Bornavirusurile asamblează vSPOTs în nucleu, iar vSPOTs-urile BoDV-1 sunt formate prin separarea de fază lichid-lichid condusă de proteina P și interacționează strâns cu cromatina, ceea ce poate constrânge difuzia și potențial direcționa poziționarea siturilor de transcriere/replicare în raport cu reperele nucleare ale gazdei[1, 3].

Genetica inversă și elementele de promotor

Semnalele reglatoare cu acțiune cis ale bornavirusului sunt concentrate în regiunile de frontieră netranslatate și terminale. În BDV, ORF-urile sunt flancate de secvențe de frontieră netranslatate care conțin semnale reglatoare pentru inițierea și oprirea transcrierii, în concordanță cu o arhitectură de tip Mononegavirales a semnalelor de start al genei și de sfârșit al genei care ghidează comportamentul polimerazei de-a lungul genomului[8]. O secvență consens de start BDV dedusă (UNCNNNUUNN) este identică cu cea dedusă prin compararea virusurilor NNS-RNA din mai multe familii de Mononegavirales, susținând conservarea motivului de inițiere utilizat de mașinăria polimerazică[4, 17]. Semnalele de terminare/poliadenilare includ un hexamer AUUUUU conservat la capătul 5′ al fiecărui semnal de terminare/poliadenilare urmat de GG (sau CG în ORF II), în timp ce semnalele putative nu au putut fi identificate pentru ORF III într-o analiză, indicând atât conservarea cât și lacune în detectabilitatea motivului de-a lungul frontierelor genice[4].

Abordările de genetică inversă și minigenom au testat direct aceste elemente reglatoare. Un sistem ARN polimerază I/polimerază II a fost stabilit pentru reconstituirea intracelulară a replicării și transcrierii ARN-ului BDV, permițând disecția controlată a cerințelor cu acțiune cis și trans[11]. În acest sistem, un analog de ARN BDV (minigenom) este sintetizat de ARN polimeraza I celulară și conține secvențe untranslated 5′ și 3′ cu acțiune cis necesare pentru sinteza ARN mediată de polimeraza BDV, legând regiunile terminale de funcția promotorului în celule[11]. Încapsidarea ARN-ului de minigenom derivat de polimeraza I de către N și P de BDV furnizate prin plasmide generează un template recunoscut de polimeraza BDV reconstituită pentru a direcționa sinteza ARN-ului antiminigenom de lungime completă (replicare) și a unui ARNm subgenomic care codifică o genă raportoare, demonstrând experimental că încapsidarea N și P este suficientă pentru a face ARN-ul competent pentru recunoașterea de către polimerază și sinteza ARN cu rezultat dublu[11].

Cartografierea promotorului rafinează în continuare modelul cu acțiune cis. Secvențele din aval (nucleotidele 25 până la 33) au fost necesare pentru o activitate optimă a promotorului, iar deleția nucleotidelor 34 până la 35 a anulat activitatea genei raportoare în acest context, identificând cerințe scurte, specifice poziției, proximale promotorului în regiunea promotorului genomic 3′[12]. Împreună, aceste date susțin o arhitectură a promotorului în care secvențele terminale compacte și elementele din aval apropiate guvernează inițierea și replicarea/transcrierea productivă în sistemul polimerazic reconstituit[11, 12].

Mecanisme de persistență

Persistența moleculară a bornavirusului este legată de dinamica capătului genomului, replicarea nucleară și organizarea nucleară specializată. Un proces de „realiniere și alungire” (realign-and-elongation) reînnoiește terminalele 3′ ale moleculelor de v- și cRNA din template-uri interne în timpul fiecărei runde de replicare și poate avea loc numai dacă terminalele sunt complete, oferind o etapă mecanică explicită care acționează ca un punct de control al calității pentru integritatea genomului[26]. Acest proces oferă un control integrat al calității care suprimă replicarea moleculelor de ARN cu deleții terminale, conectând logica reparării capetelor de selecția împotriva intermediarilor de replicare defecți[26]. În paralel, analizele terminalelor genomice în timpul infecției persistente pe termen lung au raportat un grad mai ridicat de eterogenitate terminală în ARN-urile din celulele infectate persistent comparativ cu momentele acute, indicând faptul că persistența este însoțită de schimbări în distribuția variantelor de capăt de genom[11].

Persistența este, de asemenea, asociată cu un context nuclear stabil pentru RNP-uri. Bornavirusurile au fost descrise ca fiind unice printre virusurile NNS RNA animale cunoscute care se replică și se transcriu în nucleu, ceea ce oferă cadrul compartimental celular pentru sinteza ARN-ului non-citolitic pe termen lung și procesarea nucleară a capătului genomului[2]. În plus, BoDV-1 își construiește vRNP-urile folosind cromatina gazdei ca schelă, o proprietate care poate susține mecanic persistența în nucleu prin stabilizarea poziționării vRNP în raport cu cromatina[27].

Modularea răspunsului gazdei a fost, de asemenea, legată experimental de stările de infecție. Celulele infectate cu BDV au secretat mai puțin SEAP decât celulele martor (mock) după activarea cu Pam3CSK4, sugerând că celulele infectate cu BDV suprimă activ semnalizarea NF-κB, ceea ce oferă un corelat la nivel molecular pentru semnalizarea înnăscută alterată în timpul infecției persistente[28].

Întrebări deschise

Mai multe întrebări moleculare rămân deschise sau sunt poziționate pentru experimentare țintită pe baza descoperirilor mecanice rezumate mai sus.

• Ce determinanți de secvență și structurali controlează eficiența terminării BDV și frecvența ridicată a transcrierilor readthrough, în special la T3 unde readthrough-ul este esențial pentru exprimarea polimerazei[5, 9]?
• Cum interacționează evenimentele de splicing alternativ din ARN-urile de 2.8-kb și 7.1-kb cu utilizarea frontierei transcripționale pentru a produce stoechiometrii corecte ale G și ale produselor corelate cu polimeraza, inclusiv cazurile în care expresia L necesită splicing și suprimarea terminării[6, 10]?

• Care este relația cantitativă între eterogenitatea terminală observată în timpul persistenței și activitatea promotorului, având în vedere că complementaritatea terminală perfectă nu este necesară pentru o activitate ridicată a promotorului și terminalele se diversifică în timpul infecției pe termen lung[11]?
• Cum este coordonată etapa de control al calității prin realiniere și alungire cu organizarea RNP nucleară, având în vedere că reînnoirea terminalelor 3′ provine din template-uri interne și suprimarea replicării ARN-urilor cu deleții terminale[26]?
• Care factori gazdă și repere nucleare guvernează formarea și poziționarea vSPOTs-urilor separate în fază, conduse de P, care interacționează cu cromatina și andochează la rupturile de dublă catenă ale ADN-ului neuronal[3]?
• Cum se integrează exportul nucleoproteinei dependent de CRM1 și exportul ARNm dependent de energie pentru a regla compartimentarea ARN-urilor poly(A)+ față de ARN-ul genomic poly(A)− prin învelișul nuclear[13, 15, 20]?
• Prin ce mecanism molecular suprimă proteina X acumularea ARN-ului de minigenom și cum interacționează această suprimare cu reglarea negativă dependentă de fosforilarea P a activității de cofactor a polimerazei[15, 23]?