Abstract
Bornavirussen (bijv. Borna disease virus, BDV; Borna disease virus 1, BoDV-1) zijn niet-gesegmenteerde, negatieve-strengs enkelstrengs RNA-virussen waarvan het meest kenmerkende kenmerk onder dierlijke niet-gesegmenteerde negatieve-strengs RNA (NNS-RNA) virussen is dat genoomtranscriptie en -replicatie plaatsvinden in de gastheercelkern in plaats van voornamelijk in het cytoplasma[1–3]. Moleculaire studies van BDV hebben een compact genoom van ~8,9–9 kb gedefinieerd met meerdere open reading frames die zijn georganiseerd in een klein aantal transcriptie-eenheden en geflankeerd door extracistronische terminale sequenties die fungeren als promoters en regulatoire grenzen voor virale RNA-synthese[4–8]. Genexpressie is complex en omvat de productie van zowel mono- als polycistronische poly(A)+ RNA's, frequente readthrough bij terminatieplaatsen, en het gebruik van splicing voor de expressie van belangrijke producten, waaronder het polymerase (L) in sommige transcriptcontexten[4–6, 9, 10]. Functionele reconstitutie en minigenoomsystemen hebben cis-werkende promotervereisten in het 3′-genomische uiteinde in kaart gebracht en aangetoond dat N en P templates inkapselen die worden herkend door het L/P-polymerasecomplex om zowel replicatieve als transcriptproducten te genereren[11, 12]. Nucleaire organisatie en trafficking geven verder vorm aan het replicatieprogramma, waarbij virale “speckles of transcripts” (vSPOTs) en CRM1-afhankelijke export van nucleoproteïne bijdragen aan RNP-dynamiek en compartimentering van poly(A)+ versus poly(A)− viraal RNA[3, 13–15].
Keywords
- Bornavirus[1]
- Borna disease virus[4]
- nonsegmented negative-strand RNA virus[4]
- nuclear replication[2]
- transcription readthrough[5]
- vSPOTs[3]
- minigenome[11]
- CRM1 export[15]
- phosphoprotein P[15]
- RNA-dependent RNA polymerase L[16]
Introduction
Bornavirussen zijn NNS-RNA-virussen waarvan de promoter- en gen-start consensussequenties overeenkomen met patronen die worden waargenomen bij Mononegavirales-families, wat wijst op een gedeelde negatieve-strengs transcriptielogica op het niveau van cis-werkende initiatie-elementen[4, 17]. Een centraal mechanistisch onderscheid is dat, terwijl de meeste mononegavirussen voornamelijk repliceren in het cytoplasma, bornavirussen repliceren in de celkern, waar ze gespecialiseerde nucleaire locaties voor virale RNA-synthese vestigen[1, 3]. Experimenteel bewijs ondersteunt specifiek dat BDV-replicatie en -transcriptie plaatsvinden in de kernen van geïnfecteerde cellen en geassocieerd zijn met infectieuze ribonucleoproteïnecomplexen (BDV-RNPs), wat benadrukt dat bornavirale RNA-synthese wordt uitgevoerd in de context van nucleaire RNPs[4, 13]. Nucleaire lokalisatie wordt verder ondersteund door celfractionering, die aantoont dat het meeste nieuw gesynthetiseerde BDV-RNA met genomische polariteit poly(A)− is en grotendeels wordt gevonden in de nucleaire fractie, wat consistent is met nucleaire replicatie van het genomische RNA[13].
Genome organization
BDV-genoomsequencing en mapping identificeerden een lineair genoom van ~8,9 kb met belangrijke open reading frames voorspeld over het genoom en geflankeerd door niet-coderende sequenties aan beide uiteinden[4, 5]. In één rapport werden vijf belangrijke ORFs (I–V) voorspeld in een BDV-genoomsequentie van 8.903 nt, terwijl een andere beschrijving van het BDV-genoom (8.910 nt) op vergelijkbare wijze antisense-informatie opmerkte voor vijf belangrijke ORFs, geflankeerd door 53 nt niet-coderende sequentie aan het 3′-uiteinde en 91 nt aan het 5′-uiteinde[4, 5]. Naast de structuur met vijf ORFs, heeft mapping op antigenoom-niveau drie transcriptie-eenheden en zes ORFs beschreven, en overzichtsartikelen beschrijven BDV eveneens als coderend voor zes ORFs in drie transcriptie-eenheden, omlijst door complementaire uiteinden die doen denken aan andere NNS-RNA-virussen[6, 7].
Het grootste coderende gebied (ORF V) codeert voor een voorspeld eiwit van ~170 kDa met sterke homologie met de L-eiwitfamilie van NNS-RNA-viruspolymerasen, waardoor het virale RNA-afhankelijke RNA-polymerase aan het 5′-proximale uiteinde van de genenset wordt geplaatst in de canonieke negatieve-strengs lay-out[4]. Analyse van geconserveerde sequenties identificeerde de hoogste homologie in een vermeend katalytisch domein met invariante en conservatief gehandhaafde residuen geclusterd in vier hoog-geconserveerde motieven (A–D), consistent met geconserveerde enzymatische beperkingen op polymerasefunctie onder NNS-RNA-virussen[18]. Er is gerapporteerd dat infectieuze BDV-RNPs slechts één BDV-RNA-soort bevatten, het poly(A)−, negatieve-polariteit 9-kb RNA, wat ondersteunt dat het poly(A)− RNA van genoomlengte de ingekapselde template-soort is in infectieuze RNPs[13].
Bornavirus-genomen bevatten ook regulatoire grensregio's die typisch zijn voor NNS-RNA-virussen, met ORFs geflankeerd door niet-vertaalde grenssequenties die transcriptie-initiatie- en stopsignalen bevatten[8]. Terminale sequenties kunnen basenparen vormen om een panhandle-achtige structuur te creëren, en in BDV maakte de uitlijning van genomische uiteinden de vorming van een terminale panhandle mogelijk waarbij de eerste 3 nucleotiden ongepaard bleven, waardoor terminale complementariteit werd gekoppeld aan de promoterarchitectuur zonder dat perfecte duplexvorming vereist was[5]. Belangrijk is dat analyses van BDV-genomische uiteinden zowel een gebrek aan perfecte terminale complementariteit als een verhoogde terminale sequentieheterogeniteit rapporteerden tijdens langdurige persistentie, wat aangeeft dat cis-werkende terminale regio's variabel zijn maar functioneel getolereerd worden over verschillende infectiestadia[11].
Om de genoom- en genexpressie-architectuur zoals beschreven in deze bronnen beknopt samen te vatten, contrasteert de onderstaande tabel verschillende veel geciteerde organisatorische kenmerken.
Transcription and gene expression
Genexpressie van bornavirussen in BDV omvat meerdere gepolyadenyleerde subgenomische RNA's die complementair zijn aan het negatieve-strengs genoom, waarbij één studie negen soorten gepolyadenyleerde subgenomische RNA's identificeerde, waaronder zes polycistronische poly(A)+ RNA's en monocistronische mRNA's die overeenkomen met ORFs I, II en IV[4]. In dezelfde analyse werden monocistronische poly(A)+ RNA's voor ORFs III en V niet gedetecteerd, wat aangeeft dat de expressie van sommige coderende regio's in BDV niet wordt gedomineerd door eenvoudige monocistronische boodschappen[4]. Northern-analyses toonden ook aan dat BDV zowel mono- als polycistronische RNA's transcribeert en terminatie-/polyadenyleringssignalen gebruikt die doen denken aan andere negatieve-strengs RNA-virussen, consistent met een stop-start transcriptieprogramma dat desalniettemin resulteert in frequente transcriptcontinuïteit voorbij terminatieplaatsen[5].
Terminatie en polyadenylering omvatten discrete plaatsen en een herkenbaar signaal. Northern-hybridisatie-experimenten ondersteunden het gebruik van specifieke terminatieplaatsen (T2, T3, T5 en T7) en identificeerden een consensussequentie voor het terminatie-/polyadenyleringssignaal, wat moleculaire markeringspunten oplevert voor transcriptgrenzen en de neiging tot readthrough[5]. BDV is ook opmerkelijk vanwege een hoge frequentie van readthrough-transcripten in vergelijking met andere negatieve-strengs RNA-virussen, wat impliceert dat terminatie-efficiëntie systematisch wordt afgestemd en mechanistisch essentieel kan zijn[5]. Inderdaad is readthrough van T3 essentieel voor de expressie van p190 (polymerase-eiwit), waardoor terminatie-onderdrukking rechtstreeks wordt gekoppeld aan de beschikbaarheid van polymerase en daarmee aan de capaciteit voor replicatie en transcriptie[9].
BDV-mRNA's zijn gecapt en gepolyadenyleerd, wat aantoont dat mRNA-rijping consistent is met de productie van translatie-competente RNA's ondanks de nucleaire replicatienis[19]. Extra coderende diversiteit wordt gegenereerd door splicing, aangezien de 2,8-kb en 7,1-kb RNA's twee introns bevatten die differentieel worden gespliced om RNA's op te leveren die coderen voor meerdere producten, waaronder G en polymerase-gerelateerde eiwitten; afzonderlijke verklaringen geven aan dat L-expressie splicing en onderdrukking van terminatie vereist[6, 10]. Op het niveau van initiatie en promoterstructuur lijkt perfecte terminale complementariteit niet vereist te zijn voor een hoge promoteractiviteit, en verhoogde terminale complementariteit bevorderde replicatie versus transcriptie door het BDV-polymerase niet, wat aangeeft dat de balans tussen replicatie en transcriptie niet louter een functie is van de terminale basenparingssterkte[11].
Replication cycle overview
Replicatie van bornavirussen wordt gedefinieerd door nucleaire RNA-synthese en de nucleaire organisatie van virale RNP's. Meerdere bronnen leveren bewijs dat BDV-replicatie en -transcriptie plaatsvinden in de kern in associatie met infectieuze BDV-RNPs, wat vaststelt dat de functionele template voor RNA-synthese een RNP-complex is dat opereert in de nucleaire omgeving[4, 13]. Kwantitatieve fractionerings- en labeling-experimenten toonden verder aan dat het meeste nieuw gesynthetiseerde BDV-RNA met genomische polariteit poly(A)− en nucleair is, wat de conclusie ondersteunt dat genoomreplicatie plaatsvindt in de kern van geïnfecteerde cellen[13].
Er ontstaat een consistent compartimenteringspatroon voor verschillende virale RNA-klassen. Het BDV 9-kb poly(A)− RNA is grotendeels nucleair, terwijl nieuw gesynthetiseerde poly(A)+ RNA's naar het cytoplasmatische compartiment worden getransporteerd, wat aangeeft dat mRNA-export en genoomretentie gescheiden zijn over het kernenvelop[13, 14]. Transport van BDV-mRNA's is energie-afhankelijk gebleken, wat duidt op actieve export in plaats van passieve diffusie als een belangrijk controlepunt voor genexpressie bij nucleaire bornavirus-infecties[20].
Bornavirussen assembleren ook nucleaire virale fabrieken die worden beschreven als “viral Speckles Of Transcripts” (vSPOTs), wat een structurele context biedt voor geconcentreerde transcriptie/replicatie en potentieel gecoördineerde RNA-verwerking in de kern[1]. In BoDV-1 zijn vSPOTs, gevormd door vloeistof-vloeistof fasescheiding aangedreven door het P-eiwit, aanwezig in de kern en interageren ze nauw met chromatine, inclusief docking op dubbelstrengs DNA-breuken in neuronen, waardoor replicatieplaatsen worden gekoppeld aan specifieke nucleaire substructuren[3]. Consistent met de centrale rol van RNPs, is gerapporteerd dat BDV-RNP-complexen die alleen de 9-kb RNA-soort bevatten, de polymerase-activiteit bezitten die nodig is voor transcriptie en de genetische informatie dragen die nodig is om de synthese van BDV-macromoleculen en de productie van infectieuze BDV-deeltjes aan te sturen, waardoor genoom-lengte RNPs worden verbonden met stroomafwaartse stappen in de virale levenscyclus[21].
RNP and polymerase machinery
Het BDV-RNA van genoomlengte is verpakt in RNP-complexen die N en het virale RNA-afhankelijke RNA-polymerasecomplex bevatten, wat de kernmachinerie definieert als een nucleocapsid-template gebonden door het polymerasecomplex[15]. Het RdRp-complex bestaat uit P en L en is verantwoordelijk voor de replicatie en transcriptie van het virale genoom, waarbij L de katalytische eenheid is en P een essentiële polymerase-cofactor in BDV[15]. Structurele en functionele beschrijvingen definiëren L verder als een RdRp van ~192 kDa die de kern vormt van het replicatiecomplex, transcriptie en replicatie uitvoert om viraal mRNA en nieuwe genoomkopieën te produceren, en associeert met P voor efficiënte RNA-synthese[16].
Eiwitinteractie-eigenschappen van P bieden mechanistisch inzicht in de polymerasefunctie. P associeert met zichzelf in oligomeren via een centraal oligomerisatiedomein en vormt een brug tussen het RdRp en het nucleocapsid; het fungeert ook als chaperone voor N om het in een RNA-vrije vorm te houden die nodig is voor replicatie, wat een model ondersteunt waarin P zowel enzymrekrutering als template-gereedheid coördineert[3]. In lijn hiermee werd door experimentele verstoring van P-oligomerisatie in een minireplicon-assay onderzocht of oligomerisatie-defecte P-mutanten functionele polymerasecomplexen konden reconstitueren; geen van de P-mutanten ondersteunde reporterexpressie, wat aangeeft dat P-oligomerisatie vereist is voor polymerase-activiteit onder deze omstandigheden[22]. Daarnaast wordt de cofactor-activiteit van P voor BDV RdRp negatief gereguleerd door fosforylering, wat een expliciete post-translationele regulatoire hendel biedt voor de polymerasefunctie[15].
Bornavirus-nucleoproteïne-isoformen verbinden eiwitfunctie ook met intracellulaire lokalisatie. Experimenten waarbij p40 en p38 tot expressie werden gebracht, toonden aan dat p40 voornamelijk nucleair is, terwijl p38 voornamelijk cytoplasmatisch is, maar beide binden het BDV-fosfoproteïne P, wat suggereert dat isoform-afhankelijke lokalisatie gekoppeld aan P-binding kan moduleren waar RNP-assemblage en/of -functie plaatsvindt[9]. Consistent met een nucleaire targetingrol voor P, bevat P een sterk bipartiet nucleair lokalisatiesignaal (NLS) aan de amino-terminus en aanvullende zwakkere NLS-motieven, wat nucleaire import van polymerase-bevattende complexen ondersteunt als een mechanistische eerste vereiste voor nucleaire RNA-synthese[9].
Ten slotte kan het accessoire eiwit X de RNA-synthese in gereconstitueerde systemen direct neerwaarts moduleren. Wanneer BDV-polymerasecomplexen werden gereconstitueerd in cellen die het X-eiwit tot expressie brachten, werd er geen plus-strengs minigenoom-RNA gedetecteerd, wat suggereert dat X zowel virale transcriptie als replicatie remt in die assaycontext[23]. Deze waarnemingen samen ondersteunen een machineriemodel waarin L en P de katalytische kern vormen, P-oligomerisatie en -fosforylering de polymerase-competentie reguleren, and accessoire factoren zoals X de polymerase-output onder gedefinieerde omstandigheden kunnen onderdrukken[15, 23].
Nuclear trafficking
Bornavirussen koppelen nucleaire replicatie aan gereguleerd nucleocytoplasmatisch transport van RNP-componenten en RNA-soorten. Direct bewijs geeft aan dat BDV-replicatie en -transcriptie plaatsvinden in kernen waar infectieuze BDV-RNPs aanwezig zijn, en fractionering geeft aan dat nieuw gesynthetiseerd RNA met genomische polariteit sterk verrijkt is in de nucleaire fractie, wat een functionele impuls geeft aan nucleaire import- en exportpaden om de levenscyclus te coördineren[13, 21]. RNA-transportassays geven aan dat nieuw gesynthetiseerde BDV-poly(A)+ RNA's efficiënt naar het cytoplasmatische compartiment worden getransporteerd, terwijl het 9-kb genomische RNA grotendeels nucleair blijft, wat duidt op RNA-klasse-specifiek exportgedrag[14]. Bovendien is mRNA-transport energie-afhankelijk, met verwaarloosbare export in afwezigheid van ATP, wat actieve, gastheerfactor-afhankelijke exportmechanismen voor virale mRNA's ondersteunt[20].
Voor eiwittransport is CRM1-afhankelijke export geïmpliceerd voor nucleoproteïne. De nucleaire export van N verloopt via een CRM1-afhankelijk pad dat consistent is met een NES, en een afzonderlijke verklaring meldt op vergelijkbare wijze dat nucleaire export van BoDV-N plaatsvindt via een CRM1-afhankelijk pad, wat wijst op de conservatie van deze exportroute binnen bornavirussen[15, 24]. Bredere reviews stellen verder dat verschillende BDV-eiwitten (waaronder nucleoproteïne, fosfoproteïne, X en L) bijdragen aan het nucleocytoplasmatisch transport van het BDV-RNP, en dat directionele controle waarschijnlijk wordt bepaald door de verhoudingen en interacties tussen NLS- en NES-elementen in het RNP, waarbij transport wordt gezien als een emergente eigenschap van concurrerende lokalisatiesignalen in plaats van een enkele determinant[25].
De vorming van nucleaire virale fabrieken biedt een extra organisatieniveau dat relevant is voor transport. Bornavirussen assembleren vSPOTs in de kern, en BoDV-1 vSPOTs worden gevormd door vloeistof-vloeistof fasescheiding aangedreven door het P-eiwit en interageren nauw met chromatine, wat diffusie kan beperken en potentieel de positionering van transcriptie-/replicatieplaatsen ten opzichte van nucleaire herkenningspunten van de gastheer kan sturen[1, 3].
Reverse genetics and promoter elements
Cis-werkende regulatoire signalen van bornavirussen zijn geconcentreerd in niet-vertaalde grens- en terminale regio's. In BDV worden ORFs geflankeerd door niet-vertaalde grenssequenties die regulatoire signalen bevatten voor transcriptie-initiatie en -stop, consistent met een Mononegavirales-achtige architectuur van gen-start- en gen-eindsignalen die het gedrag van het polymerase langs het genoom sturen[8]. Een afgeleide BDV-startconsensussequentie (UNCNNNUUNN) is identiek aan die welke is afgeleid door NNS-RNA-virussen over meerdere Mononegavirales-families te vergelijken, wat de conservatie ondersteunt van het initiatiemotief dat door de polymerasemachinerie wordt gebruikt[4, 17]. Terminatie-/polyadenyleringssignalen bevatten een geconserveerd AUUUUU-hexameer aan het 5′-uiteinde van elk terminatie-/polyadenyleringssignaal gevolgd door GG (of CG in ORF II), terwijl vermeende signalen voor ORF III in één analyse niet konden worden geïdentificeerd, wat wijst op zowel conservatie als hiaten in de detecteerbaarheid van motieven over gen-grenzen heen[4].
Reverse-genetics en minigenoom-benaderingen hebben deze regulatoire elementen direct getest. Er werd een RNA-polymerase I/polymerase II-systeem opgezet voor intracellulaire reconstitutie van BDV-RNA-replicatie en -transcriptie, waardoor gecontroleerde dissectie van cis- en trans-werkende vereisten mogelijk werd[11]. In dit systeem wordt een BDV-RNA-analoog (minigenoom) gesynthetiseerd door cellulair RNA-polymerase I, dat BDV 5′- en 3′-niet-vertaalde cis-werkende sequenties bevat die vereist zijn voor door BDV-polymerase gemedieerde RNA-synthese, waardoor terminale regio's worden gekoppeld aan de promoterfunctie in cellen[11]. Inkapseling van door polymerase I afgeleid minigenoom-RNA door via plasmiden geleverde BDV N en P genereert een template die wordt herkend door het gereconstitueerde BDV-polymerase om de synthese van full-length antiminigenoom-RNA (replicatie) en een subgenomisch mRNA coderend voor een reportergen aan te sturen, wat experimenteel aantoont dat inkapseling door N en P voldoende is om het RNA competent te maken voor polymeraseherkenning en RNA-synthese met dubbele output[11].
Promoter-mapping verfijnt het cis-werkende model verder. Stroomafwaartse sequenties (nucleotiden 25 tot 33) waren vereist voor optimale promoteractiviteit, en depletie van nucleotiden 34 tot 35 hief de reporteractiviteit in deze context op, wat korte, positie-specifieke promoter-proximale vereisten identificeerde in de 3′-genomische promoterregio[12]. Samen ondersteunen deze gegevens een promoterarchitectuur waarin compacte terminale sequenties en nabijgelegen stroomafwaartse elementen de initiatie en productieve replicatie/transcriptie in het gereconstitueerde polymerasesysteem beheersen[11, 12].
Persistence mechanisms
Moleculaire persistentie van bornavirussen is gekoppeld aan de dynamiek van de genoombuites, nucleaire replicatie en gespecialiseerde nucleaire organisatie. Een “realign-and-elongation”-proces vernieuwt de 3′-termini van v- en cRNA-moleculen van interne templates tijdens elke replicatieronde en kan alleen plaatsvinden als de termini volledig zijn, wat een expliciete mechanistische stap biedt die fungeert als een kwaliteitscontrolepunt voor genoomintegriteit[26]. Dit proces biedt een geïntegreerde kwaliteitscontrole die de replicatie onderdrukt van RNA-moleculen met terminale depletie, waarbij end-repair-logica wordt verbonden met selectie tegen defecte replicatie-intermediairen[26]. Parallel hieraan rapporteerden analyses van genomische uiteinden tijdens langdurige persistente infectie een hogere mate van terminale heterogeniteit in RNA's van persistent geïnfecteerde cellen vergeleken met acute tijdstippen, wat aangeeft dat persistentie gepaard gaat met verschuivingen in de distributie van genoom-eindvarianten[11].
Persistentie is ook geassocieerd met een stabiele nucleaire context voor RNPs. Bornavirussen zijn beschreven als uniek onder de bekende dierlijke NNS-RNA-virussen omdat ze repliceren en transcriberen in de kern, wat de cellulaire compartimentele setting biedt voor langdurige niet-cytolytische RNA-synthese en nucleaire genoom-eindverwerking[2]. Bovendien bouwt BoDV-1 zijn vRNPs op met host-chromatine als steunstructuur, een eigenschap die persistentie in de kern mechanistisch kan ondersteunen door de positionering van vRNPs ten opzichte van chromatine te stabiliseren[27].
Modulatie van de gastheerrespons is ook experimenteel gekoppeld aan infectiestadia. Met BDV geïnfecteerde cellen scheidden minder SEAP uit dan mock-cellen na Pam3CSK4-activatie, wat suggereert dat met BDV geïnfecteerde cellen actief de NF-κB-signalering onderdrukken, wat een moleculair correlaat biedt voor veranderde aangeboren signalering tijdens persistente infectie[28].
Open questions
Verschillende moleculaire vragen blijven openstaan of zijn gepositioneerd voor gericht experimenteel onderzoek op basis van de hierboven samengevatte mechanistische bevindingen.
- Welke sequentie- en structurele determinanten controleren de BDV-terminatie-efficiëntie en de hoge frequentie van readthrough-transcripten, met name bij T3 waar readthrough essentieel is voor polymerase-expressie[5, 9]?
- Hoe interfereren alternatieve splicing-events in de 2,8-kb en 7,1-kb RNA's met het gebruik van transcriptiegrenzen om de juiste stoichiometrie van G en polymerase-gerelateerde producten op te leveren, inclusief gevallen waarin L-expressie splicing en onderdrukking van terminatie vereist[6, 10]?
- Wat is de kwantitatieve relatie tussen terminale heterogeniteit waargenomen tijdens persistentie en promoteractiviteit, gezien het feit dat perfecte terminale complementariteit niet vereist is voor hoge promoteractiviteit en termini diversifiëren tijdens langdurige infectie[11]?
- Hoe wordt de realign-and-elongation-kwaliteitscontrolestap gecoördineerd met de nucleaire RNP-organisatie, aangezien de vernieuwing van 3′-termini afkomstig is van interne templates en de replicatie van terminaal gedeleteerde RNA's onderdrukt[26]?
- Welke gastheerfactoren en nucleaire herkenningspunten sturen de vorming en positionering van door P aangedreven fase-gescheiden vSPOTs die interageren met chromatine en docken op dubbelstrengs DNA-breuken in neuronen[3]?
- Hoe integreren de CRM1-afhankelijke export van nucleoproteïne en energie-afhankelijke mRNA-export om de compartimentering van poly(A)+ RNA's versus poly(A)− genomisch RNA over de kernenvelop te reguleren[13, 15, 20]?
- Via welk moleculair mechanisme onderdrukt het X-eiwit de accumulatie van minigenoom-RNA, en hoe kruist deze onderdrukking met de P-fosforylering-afhankelijke negatieve regulatie van polymerase-cofactoractiviteit[15, 23]?
