Bornawirusy: Organizacja genomu, replikacja jądrowa i mechanizmy ekspresji genów

Streszczenie

Bornawirusy (np. wirus choroby bornańskiej, BDV; wirus choroby bornańskiej 1, BoDV-1) to niesegmentowane wirusy o jednoniciowym RNA o ujemnej polarności, których najbardziej charakterystyczną cechą wśród zwierzęcych niesegmentowanych wirusów RNA o ujemnej polarności (NNS-RNA) jest to, że transkrypcja i replikacja genomu zachodzą w jądrze komórkowym gospodarza, a nie głównie w cytoplazmie[1–3]. Badania molekularne BDV zdefiniowały zwarty genom o wielkości ~8.9–9 kb z wieloma otwartymi ramkami odczytu zorganizowanymi w niewielką liczbę jednostek transkrypcyjnych i otoczonymi przez pozacystronowe sekwencje terminalne, które funkcjonują jako promotory i granice regulacyjne dla syntezy wirusowego RNA[4–8]. Ekspresja genów jest złożona i obejmuje produkcję zarówno mono-, jak i policistronowych poli(A)+ RNA, częsty odczyt przelotowy (readthrough) w miejscach terminacji oraz wykorzystanie splicingu do ekspresji kluczowych produktów, w tym polimerazy (L) w niektórych kontekstach transkrypcyjnych[4–6, 9, 10]. Systemy funkcjonalnej rekonstytucji i minigenomowe pozwoliły zmapować wymogi promotorowe działające w układzie cis na końcu 3′ genomu i wykazały, że N i P enkapsydują matryce rozpoznawane przez kompleks polimerazy L/P w celu generowania produktów zarówno replikacyjnych, jak i transkrypcyjnych[11, 12]. Organizacja jądrowa i transport wewnątrzkomórkowy dodatkowo kształtują program replikacji, przy czym wirusowe „plamki transkrypcyjne” (vSPOTs) oraz zależny od CRM1 eksport nukleoproteiny przyczyniają się do dynamiki RNP i kompartymentacji wirusowych RNA poli(A)+ względem poli(A)−[3, 13–15].

Słowa kluczowe

• Bornavirus[1]
• Borna disease virus[4]
• nonsegmented negative-strand RNA virus[4]
• nuclear replication[2]
• transcription readthrough[5]
• vSPOTs[3]
• minigenome[11]
• CRM1 export[15]
• phosphoprotein P[15]
• RNA-dependent RNA polymerase L[16]

Wstęp

Bornawirusy to wirusy NNS-RNA, których sekwencje promotorowe i konsensusowe sekwencje startowe genów są zgodne ze wzorcami obserwowanymi w rodzinach rzędu Mononegavirales, co wskazuje na wspólną logikę transkrypcji nici ujemnej na poziomie elementów inicjacyjnych działających w układzie cis[4, 17]. Główną różnicą mechaniczną jest to, że podczas gdy większość mononegawirusów replikuje się głównie w cytoplazmie, bornawirusy replikują się w jądrze, gdzie tworzą wyspecjalizowane miejsca jądrowe dla syntezy wirusowego RNA[1, 3]. Dowody eksperymentalne specyficznie potwierdzają, że replikacja i transkrypcja BDV odbywają się w jądrach zakażonych komórek i są powiązane z zakaźnymi kompleksami rybonukleoproteinowymi (BDV-RNPs), co podkreśla, że synteza bornawirusowego RNA jest realizowana w kontekście jądrowych RNPs[4, 13]. Lokalizacja jądrowa jest dodatkowo wspierana przez frakcjonowanie komórkowe wykazujące, że większość nowo zsyntetyzowanego BDV RNA o polarności genomowej to poli(A)− i znajduje się głównie we frakcji jądrowej, co jest zgodne z jądrową replikacją genomowego RNA[13].

Organizacja genomu

Sekwencjonowanie i mapowanie genomu BDV pozwoliło zidentyfikować liniowy genom o wielkości ~8.9 kb z głównymi otwartymi ramkami odczytu przewidywanymi w całym genomie i otoczonymi przez sekwencje niekodujące na obu końcach[4, 5]. W jednym raporcie przewidziano pięć głównych ORF (I–V) w sekwencji genomu BDV o długości 8,903 nt, podczas gdy inny opis genomu BDV (8,910 nt) podobnie odnotował informację antysensowną dla pięciu głównych ORF otoczonych przez 53 nt sekwencji niekodującej na końcu 3′ i 91 nt na końcu 5′[4, 5]. Oprócz struktury opartej na pięciu ORF, mapowanie na poziomie antygenomu opisało trzy jednostki transkrypcyjne i sześć ORF, a podsumowania przeglądowe również opisują BDV jako kodujący sześć ORF w trzech jednostkach transkrypcyjnych obramowanych przez komplementarne końce, co przypomina inne wirusy NNS RNA[6, 7].

Największy region kodujący (ORF V) koduje przewidywane białko o masie ~170 kDa z silną homologią do rodziny białek L polimeraz wirusów NNS-RNA, co umieszcza wirusową polimerazę RNA-zależną na końcu bliskim 5′ zestawu genów w kanonicznym układzie nici ujemnej[4]. Analiza konserwatywnych sekwencji wykazała najwyższą homologię w domniemanej domenie katalitycznej z niezmiennymi i konserwatywnie utrzymanymi pozostałościami skupionymi w czterech wysoce konserwatywnych motywach (A–D), co jest zgodne z konserwatywnymi ograniczeniami enzymatycznymi funkcji polimerazy wśród wirusów NNS-RNA[18]. Doniesiono, że zakaźne BDV-RNPs zawierają tylko jeden gatunek BDV RNA, poli(A)− o polarności ujemnej i wielkości 9 kb, co potwierdza, że poli(A)− RNA o długości genomowej jest gatunkiem matrycy enkapsydowanej w zakaźnych RNPs[13].

Genomy bornawirusów niosą również regulacyjne regiony graniczne typowe dla wirusów NNS-RNA, z ORF otoczonymi przez nietranslowane sekwencje graniczne, które obejmują sygnały inicjacji i zatrzymania transkrypcji[8]. Sekwencje terminalne mogą tworzyć pary zasad, tworząc strukturę przypominającą uchwyt patelni (panhandle), a w BDV dopasowanie końców genomowych pozwoliło na utworzenie terminalnego panhandle z pierwszymi 3 nukleotydami niesparowanymi, łącząc terminalną komplementarność z architekturą promotora bez wymogu idealnego podwójnego splotu[5]. Co ważne, analizy końców genomowych BDV wykazały zarówno brak idealnej komplementarności terminalnej, jak i zwiększoną heterogenność sekwencji terminalnych podczas długotrwałej persistencji, co wskazuje, że regiony terminalne działające w układzie cis są zmienne, lecz funkcjonalnie tolerowane w różnych stanach infekcji[11].

Aby zwięźle podsumować architekturę genomu i ekspresji genów opisaną w tych źródłach, poniższa tabela zestawia kilka często cytowanych cech organizacyjnych.

Transkrypcja i ekspresja genów

Ekspresja genów bornawirusa w BDV obejmuje wiele poliadenylowanych subgenomowych RNA komplementarnych do genomu o ujemnej polarności, przy czym jedno badanie zidentyfikowało dziewięć gatunków poliadenylowanych subgenomowych RNA, w tym sześć policistronowych poli(A)+ RNA oraz monocistronowe mRNA odpowiadające ORF I, II i IV[4]. W tej samej analizie nie wykryto monocistronowych poli(A)+ RNA dla ORF III i V, co wskazuje, że ekspresja niektórych regionów kodujących nie jest zdominowana przez proste przekazy monocistronowe w BDV[4]. Analizy Northern wykazały również, że BDV transkrybuje zarówno mono-, jak i policistronowe RNA oraz wykorzystuje sygnały terminacji/poliadenylacji przypominające inne wirusy RNA o ujemnej polarności, co jest zgodne z programem transkrypcyjnym typu stop–start, który niemniej jednak skutkuje częstą ciągłością transkryptu poza miejscami terminacji[5].

Terminacja i poliadenylacja angażują dyskretne miejsca i rozpoznawalny sygnał. Eksperymenty hybrydyzacji Northern potwierdziły wykorzystanie specyficznych miejsc terminacji (T2, T3, T5 i T7) i zidentyfikowały sekwencję konsensusową sygnału terminacji/poliadenylacji, dostarczając molekularnych punktów orientacyjnych dla granic transkryptu i skłonności do odczytu przelotowego (readthrough)[5]. BDV wyróżnia się również wysoką częstotliwością transkryptów readthrough w porównaniu z innymi wirusami RNA o ujemnej polarności, co sugeruje, że wydajność terminacji jest systematycznie dostrajana i może być mechanistycznie istotna[5]. Rzeczywiście, readthrough T3 jest niezbędny dla ekspresji p190 (białka polimerazy), bezpośrednio łącząc supresję terminacji z dostępnością polimerazy, a tym samym ze zdolnością do replikacji i transkrypcji[9].

mRNA BDV posiadają czapeczkę i są poliadenylowane, co wykazuje, że dojrzewanie mRNA jest spójne z produkcją RNA zdolnych do translacji mimo niszy replikacyjnej w jądrze[19]. Dodatkowa różnorodność kodowania jest generowana przez splicing, jako że RNA 2.8-kb i 7.1-kb zawierają dwa introny, które podlegają różnicowemu splicingowi, dając RNA kodujące wiele produktów, w tym białka G i białka związane z polimerazą; oddzielne doniesienia wskazują, że ekspresja L wymaga splicingu i supresji terminacji[6, 10]. Na poziomie inicjacji i struktury promotora, idealna komplementarność terminalna nie wydaje się być wymagana dla wysokiej aktywności promotora, a zwiększona komplementarność terminalna nie promowała replikacji względem transkrypcji przez polimerazę BDV, co wskazuje, że równowaga między replikacją a transkrypcją nie jest po prostu funkcją siły terminalnego parowania zasad[11].

Przegląd cyklu replikacyjnego

Replikacja bornawirusów jest definiowana przez jądrową syntezę RNA i jądrową organizację wirusowych RNPs. Wiele źródeł dostarcza dowodów na to, że replikacja i transkrypcja BDV zachodzą w jądrze w powiązaniu z zakaźnymi BDV-RNPs, ustalając, że funkcjonalną matrycą dla syntezy RNA jest kompleks RNP operujący w środowisku jądrowym[4, 13]. Ilościowe eksperymenty frakcjonowania i znakowania wykazały ponadto, że większość nowo zsyntetyzowanego RNA BDV o polarności genomowej to poli(A)− i znajduje się w jądrze, co wspiera wniosek, że replikacja genomu odbywa się w jądrze zakażonych komórek[13].

Dla różnych klas wirusowego RNA wyłania się spójny wzorzec kompartymentacji. BDV 9-kb poli(A)− RNA znajduje się głównie w jądrze, podczas gdy nowo zsyntetyzowane poli(A)+ RNA są transportowane do cytoplazmy, co wskazuje, że eksport mRNA i retencja genomu są rozdzielone barierą otoczki jądrowej[13, 14]. Wykazano, że transport mRNA BDV jest zależny od energii, co sugeruje aktywny eksport, a nie pasywną dyfuzję, jako kluczowy punkt kontrolny ekspresji genów w infekcji bornawirusowej w jądrze[20].

Bornawirusy tworzą również jądrowe fabryki wirusowe określane jako „wirusowe plamki transkrypcyjne” (vSPOTs), zapewniające kontekst strukturalny dla skoncentrowanej transkrypcji/replikacji i potencjalnie skoordynowanego przetwarzania RNA w jądrze[1]. W przypadku BoDV-1, vSPOTs utworzone przez separację faz ciecz-ciecz napędzaną przez białko P są obecne w jądrze i ściśle oddziałują z chromatyną, w tym dokują na pęknięciach obu nici neuronalnego DNA, łącząc miejsca replikacji ze specyficznymi substrukturami jądrowymi[3]. Zgodnie z centralną rolą RNPs, doniesiono, że kompleksy BDV-RNP zawierające tylko gatunek RNA o wielkości 9-kb posiadają aktywność polimerazy wymaganą do transkrypcji i niosą informację genetyczną potrzebną do kierowania syntezą makrocząsteczek BDV oraz produkcji zakaźnych cząstek BDV, łącząc RNPs o długości genomowej z dalszymi etapami cyklu życiowego wirusa[21].

Aparat RNP i polimerazy

RNA BDV o długości genomowej jest pakowane w kompleksy RNP, które zawierają N oraz wirusowy kompleks polimerazy RNA-zależnej, co definiuje rdzeń aparatu jako matrycę nukleokapsydu związaną przez kompleks polimerazy[15]. Kompleks RdRp składa się z P oraz L i odpowiada za replikację i transkrypcję wirusowego genomu, ustalając L jako podjednostkę katalityczną, a P jako niezbędny kofaktor polimerazy w BDV[15]. Opisy strukturalne i funkcjonalne dodatkowo definiują L jako RdRp o masie ~192 kDa, tworzącą rdzeń kompleksu replikacyjnego, wykonującą transkrypcję i replikację w celu produkcji wirusowego mRNA i nowych kopii genomu oraz asocjującą z P w celu wydajnej syntezy RNA[16].

Właściwości interakcji białkowych P dostarczają wglądu mechanistycznego w funkcję polimerazy. P ulega samoasocjacji w oligomery poprzez centralną domenę oligomeryzacji i stanowi pomost między RdRp a nukleokapsydem, a także pełni rolę chaperonu dla N, utrzymując go w formie wolnej od RNA, niezbędnej do replikacji, co wspiera model, w którym P koordynuje zarówno rekrutację enzymu, jak i gotowość matrycy[3]. Zgodnie z tym, eksperymentalne zaburzenie oligomeryzacji P w teście minireplikonowym pozwoliło sprawdzić, czy mutanty P z defektem oligomeryzacji mogą odtworzyć funkcjonalne kompleksy polimerazy; żaden z mutantów P nie wspierał ekspresji reporterowej, co wskazuje, że oligomeryzacja P jest wymagana dla aktywności polimerazy w tych warunkach[22]. Ponadto aktywność kofaktora P dla RdRp BDV jest negatywnie regulowana przez fosforylację, co stanowi wyraźny posttranslacyjny mechanizm regulacji funkcji polimerazy[15].

Izoformy nukleoproteiny bornawirusa również łączą funkcję białka z lokalizacją wewnątrzkomórkową. Eksperymenty z ekspresją p40 i p38 wykazały, że p40 znajduje się głównie w jądrze, podczas gdy p38 głównie w cytoplazmie, jednak oba wiążą fosfobiałko P wirusa BDV, co sugeruje, że lokalizacja zależna od izoformy w połączeniu z wiązaniem P może modulować miejsce, w którym zachodzi składanie i/lub funkcjonowanie RNP[9]. Zgodnie z rolą P w kierowaniu do jądra, P zawiera silny dwuczęściowy sygnał lokalizacji jądrowej (NLS) na swoim końcu aminowym oraz dodatkowe słabsze motywy NLS, co wspiera import jądrowy kompleksów zawierających polimerazę jako mechanistyczny warunek wstępny jądrowej syntezy RNA[9].

Wreszcie, białko pomocnicze X może bezpośrednio osłabiać syntezę RNA w systemach rekonstytuowanych. Gdy kompleksy polimerazy BDV zostały rekonstytuowane w komórkach wykazujących ekspresję białka X, nie wykryto RNA minigenomu o polarności dodatniej, co sugeruje, że X hamuje zarówno wirusową transkrypcję, jak i replikację w tym kontekście badawczym[23]. Obserwacje te razem wspierają model aparatu, w którym L i P tworzą rdzeń katalityczny, oligomeryzacja i fosforylacja P regulują kompetencję polimerazy, a czynniki pomocnicze, takie jak X, mogą tłumić wydajność polimerazy w określonych warunkach[15, 23].

Transport jądrowy

Bornawirusy łączą replikację jądrową z regulowanym transportem jądrowo-cytoplazmatycznym komponentów RNP i gatunków RNA. Bezpośrednie dowody wskazują, że replikacja i transkrypcja BDV odbywają się w jądrach, w których obecne są zakaźne RNPs BDV, a frakcjonowanie wskazuje, że nowo zsyntetyzowane RNA o polarności genomowej jest silnie wzbogacone we frakcji jądrowej, co stanowi funkcjonalny impuls dla ścieżek importu i eksportu jądrowego w celu koordynacji cyklu życiowego[13, 21]. Testy transportu RNA wskazują, że nowo zsyntetyzowane poli(A)+ RNA wirusa BDV są wydajnie transportowane do cytoplazmy, podczas gdy genomowe RNA 9-kb pozostaje głównie w jądrze, wykazując zachowanie eksportowe specyficzne dla klasy RNA[14]. Co więcej, transport mRNA jest zależny od energii, z nieznacznym eksportem w przypadku braku ATP, co wspiera aktywne, zależne od czynników gospodarza mechanizmy eksportu wirusowych mRNA[20].

W przypadku transportu białek, eksport zależny od CRM1 jest sugerowany dla nukleoproteiny. Eksport jądrowy N odbywa się poprzez ścieżkę zależną od CRM1, co jest zgodne z obecnością NES, a oddzielne doniesienie podobnie informuje, że eksport jądrowy BoDV-N zachodzi ścieżką zależną od CRM1, co wskazuje na konserwację tej drogi eksportu u bornawirusów[15, 24]. Szersze przeglądy stwierdzają ponadto, że kilka białek BDV (w tym nukleoproteina, fosfobiałko, X oraz L) przyczynia się do transportu jądrowo-cytoplazmatycznego RNP BDV, a kontrola kierunkowa jest prawdopodobnie determinowana przez proporcje i interakcje między elementami NLS i NES w RNP, co ukazuje transport jako wypadkową konkurujących sygnałów lokalizacji, a nie pojedynczy czynnik determinujący[25].

Tworzenie jądrowych fabryk wirusowych zapewnia dodatkowy poziom organizacyjny istotny dla transportu. Bornawirusy tworzą vSPOTs w jądrze, a vSPOTs BoDV-1 powstają w wyniku separacji faz ciecz-ciecz napędzanej przez białko P i ściśle oddziałują z chromatyną, co może ograniczać dyfuzję i potencjalnie kierować pozycjonowaniem miejsc transkrypcji/replikacji względem jądrowych punktów orientacyjnych gospodarza[1, 3].

Genetyka wsteczna i elementy promotorowe

Elementy regulacyjne bornawirusa działające w układzie cis są skoncentrowane w nietranslowanych regionach granicznych i terminalnych. W BDV, ORF są otoczone przez nietranslowane sekwencje graniczne zawierające sygnały regulacyjne dla inicjacji i zatrzymania transkrypcji, co jest zgodne z architekturą typu Mononegavirales, w której sygnały gene-start i gene-end kierują zachowaniem polimerazy wzdłuż genomu[8]. Wywnioskowana sekwencja konsensusowa startu BDV (UNCNNNUUNN) jest identyczna z tą wywnioskowaną przez porównanie wirusów NNS-RNA w wielu rodzinach Mononegavirales, co wspiera konserwację motywu inicjacyjnego używanego przez aparat polimerazy[4, 17]. Sygnały terminacji/poliadenylacji obejmują konserwatywny sześcio-mer AUUUUU na końcu 5′ każdego sygnału terminacji/poliadenylacji, po którym następuje GG (lub CG w ORF II), podczas gdy w jednej analizie nie udało się zidentyfikować domniemanych sygnałów dla ORF III, co wskazuje zarówno na konserwację, jak i luki w wykrywalności motywów na granicach genów[4].

Podejścia oparte na genetyce wstecznej i minigenomach bezpośrednio przetestowały te elementy regulacyjne. Ustanowiono system polimerazy RNA I/polimerazy II do wewnątrzkomórkowej rekonstytucji replikacji i transkrypcji RNA BDV, umożliwiając kontrolowaną analizę wymogów działających w układzie cis i trans[11]. W tym systemie analog RNA BDV (minigenom) jest syntetyzowany przez komórkową polimerazę RNA I i zawiera niekodujące sekwencje terminalne 5′ i 3′ działające w układzie cis, wymagane dla syntezy RNA za pośrednictwem polimerazy BDV, łącząc regiony terminalne z funkcją promotora w komórkach[11]. Enkapsydacja RNA minigenomu pochodzącego z polimerazy I przez dostarczone w plazmidach białka N i P wirusa BDV generuje matrycę rozpoznawaną przez rekonstytuowaną polimerazę BDV w celu kierowania syntezą pełnej długości RNA antyminigenomu (replikacja) oraz subgenomowego mRNA kodującego gen reporterowy, co eksperymentalnie wykazuje, że enkapsydacja N i P jest wystarczająca, aby uczynić RNA zdolnym do rozpoznania przez polimerazę i dwukierunkowej syntezy RNA[11].

Mapowanie promotorów dodatkowo doprecyzowuje model działania w układzie cis. Sekwencje leżące poniżej (nukleotydy 25 do 33) były wymagane dla optymalnej aktywności promotora, a delecja nukleotydów 34 do 35 znosiła aktywność reporterową w tym kontekście, identyfikując krótkie, specyficzne dla pozycji wymagania proksymalne względem promotora w regionie promotora genomowego 3′[12]. Razem dane te wspierają architekturę promotora, w której zwarte sekwencje terminalne i pobliskie elementy leżące poniżej zarządzają inicjacją oraz produktywną replikacją/transkrypcją w rekonstytuowanym systemie polimerazy[11, 12].

Mechanizmy persistencji

Molekularna persistencja bornawirusa jest związana z dynamiką końców genomu, replikacją jądrową i wyspecjalizowaną organizacją jądrową. Proces „realign-and-elongation” (wyrównania i elongacji) odnawia końce 3′ cząsteczek v- i cRNA z wewnętrznych matryc podczas każdej rundy replikacji i może zachodzić tylko wtedy, gdy końce są kompletne, co stanowi wyraźny etap mechanistyczny działający jako punkt kontrolny integralności genomu[26]. Proces ten zapewnia zintegrowaną kontrolę jakości, która tłumi replikację cząsteczek RNA z delecjami terminalnymi, łącząc logikę naprawy końców z selekcją przeciwko wadliwym produktom pośrednim replikacji[26]. Równolegle, analizy końców genomowych podczas długotrwałej infekcji przetrwałej wykazały wyższy stopień heterogenności terminalnej w RNA z komórek zakażonych persystentnie w porównaniu z punktami czasowymi ostrej infekcji, co wskazuje, że persistencji towarzyszą przesunięcia w rozkładzie wariantów końców genomu[11].

Persistencja jest również związana ze stabilnym kontekstem jądrowym dla RNPs. Bornawirusy zostały opisane jako unikalne wśród znanych zwierzęcych wirusów NNS RNA ze względu na replikację i transkrypcję w jądrze, co zapewnia komórkowe ustawienie kompartymentalne dla długotrwałej, niecytolitycznej syntezy RNA i przetwarzania końców genomu w jądrze[2]. Ponadto BoDV-1 buduje swoje vRNPs wykorzystując chromatynę gospodarza jako szkielet, co może mechanistycznie wspierać persistencję w jądrze poprzez stabilizację pozycji vRNP względem chromatyny[27].

Modulacja odpowiedzi gospodarza została również eksperymentalnie powiązana ze stanami infekcji. Komórki zakażone BDV wydzielały mniej SEAP niż komórki kontrolne po aktywacji Pam3CSK4, co sugeruje, że komórki zakażone BDV aktywnie tłumią sygnalizację NF-κB, co dostarcza molekularnego odpowiednika zmienionej sygnalizacji wrodzonej podczas infekcji przetrwałej[28].

Otwarte pytania

Kilka pytań molekularnych pozostaje otwartych lub stanowi cel dla ukierunkowanych eksperymentów w oparciu o mechanistyczne ustalenia podsumowane powyżej.

• Jakie determinanty sekwencyjne i strukturalne kontrolują wydajność terminacji BDV i wysoką częstotliwość transkryptów readthrough, szczególnie w miejscu T3, gdzie readthrough jest niezbędny dla ekspresji polimerazy[5, 9]?
• W jaki sposób alternatywne zdarzenia splicingu w RNA 2.8-kb i 7.1-kb współdziałają z wykorzystaniem granic transkrypcyjnych, aby uzyskać prawidłową stechiometrię produktów G i produktów związanych z polimerazą, w tym w przypadkach, gdy ekspresja L wymaga splicingu i supresji terminacji[6, 10]?

• Jaka jest ilościowa zależność między heterogennością terminalną obserwowaną podczas persistencji a aktywnością promotora, biorąc pod uwagę, że idealna komplementarność terminalna nie jest wymagana dla wysokiej aktywności promotora, a końce ulegają dywersyfikacji podczas długotrwałej infekcji[11]?
• Jak etap kontroli jakości realign-and-elongation jest koordynowany z organizacją jądrową RNP, biorąc pod uwagę, że odnowa końców 3′ pochodzi z wewnętrznych matryc i tłumi replikację RNA z delecjami terminalnymi[26]?
• Które czynniki gospodarza i jądrowe punkty orientacyjne zarządzają powstawaniem i pozycjonowaniem vSPOTs powstałych w wyniku separacji faz napędzanej przez białko P, które oddziałują z chromatyną i dokują na pęknięciach obu nici neuronalnego DNA[3]?
• Jak eksport nukleoproteiny zależny od CRM1 i zależny od energii eksport mRNA integrują się w celu regulacji kompartymentacji poli(A)+ RNA względem poli(A)− genomowego RNA przez otoczkę jądrową[13, 15, 20]?
• Poprzez jaki mechanizm molekularny białko X tłumi akumulację RNA minigenomu i jak ta supresja krzyżuje się z negatywną regulacją aktywności kofaktora polimerazy zależną od fosforylacji P[15, 23]?