Résumé
Les Bornavirus (par exemple, Borna disease virus, BDV ; Borna disease virus 1, BoDV-1) sont des virus à ARN monocaténaire de sens négatif non segmentés dont la caractéristique la plus distinctive parmi les virus à ARN de sens négatif non segmentés (NNS-RNA) animaux est que la transcription et la réplication du génome se produisent dans le noyau de la cellule hôte plutôt que principalement dans le cytoplasme[1–3]. Les études moléculaires du BDV ont défini un génome compact d'environ 8,9–9 kb avec plusieurs cadres de lecture ouverts organisés en un petit nombre d'unités de transcription et flanqués de séquences terminales extracistroniques qui fonctionnent comme des promoteurs et des frontières régulatrices pour la synthèse de l'ARN viral[4–8]. L'expression génique est complexe et comprend la production d'ARN poly(A)+ monocistroniques et polycistroniques, une translecture fréquente aux sites de terminaison, et l'utilisation de l'épissage pour l'expression de produits clés, y compris la polymérase (L) dans certains contextes de transcrits[4–6, 9, 10]. La reconstitution fonctionnelle et les systèmes de minigénome ont cartographié les exigences du promoteur agissant en cis à l'extrémité génomique 3' et ont montré que N et P encapsident des matrices reconnues par le complexe polymérase L/P pour générer à la fois des produits réplicatifs et des transcrits[11, 12]. L'organisation et le trafic nucléaires façonnent davantage le programme de réplication, avec des « speckles de transcrits » viraux (vSPOTs) et un export dépendant de CRM1 de la nucléoprotéine contribuant à la dynamique des RNP et à la compartimentation des ARN viraux poly(A)+ par rapport aux poly(A)−[3, 13–15].
Mots-clés
- Bornavirus[1]
- Borna disease virus[4]
- virus à ARN de sens négatif non segmenté[4]
- réplication nucléaire[2]
- translecture de la transcription[5]
- vSPOTs[3]
- minigénome[11]
- export CRM1[15]
- phosphoprotéine P[15]
- ARN polymérase ARN-dépendante L[16]
Introduction
Les Bornavirus sont des virus NNS-RNA dont les séquences consensus du promoteur et de début de gène s'alignent sur les modèles observés dans les familles de Mononegavirales, indiquant une logique de transcription de brin négatif partagée au niveau des éléments d'initiation agissant en cis[4, 17]. Une distinction mécanistique centrale est que, alors que la plupart des mononégavirus se répliquent principalement dans le cytoplasme, les bornavirus se répliquent dans le noyau, où ils établissent des sites nucléaires spécialisés pour la synthèse de l'ARN viral[1, 3]. Des preuves expérimentales soutiennent spécifiquement que la réplication et la transcription du BDV ont lieu dans les noyaux des cellules infectées et sont associées à des complexes de ribonucléoprotéines infectieux (BDV-RNPs), soulignant que la synthèse de l'ARN bornaviral est exécutée dans le contexte des RNP nucléaires[4, 13]. La localisation nucléaire est en outre étayée par le fractionnement cellulaire montrant que la plupart des ARN de BDV de polarité génomique nouvellement synthétisés sont poly(A)− et se trouvent largement dans la fraction nucléaire, ce qui est cohérent avec une réplication nucléaire de l'ARN génomique[13].
Organisation du génome
Le séquençage et la cartographie du génome du BDV ont identifié un génome linéaire d'environ 8,9 kb avec des cadres de lecture ouverts majeurs prédits sur l'ensemble du génome et flanqués de séquences non codantes aux deux extrémités[4, 5]. Dans un rapport, cinq ORF majeurs (I–V) ont été prédits dans une séquence génomique du BDV de 8 903 nt, tandis qu'une autre description du génome du BDV (8 910 nt) a noté de manière similaire des informations antisens pour cinq ORF majeurs flanqués de 53 nt de séquence non codante à l'extrémité 3' et de 91 nt à l'extrémité 5'[4, 5]. En plus du cadrage à cinq ORF, la cartographie au niveau de l'antigénome a décrit trois unités de transcription et six ORF, et des résumés de niveau revue décrivent également le BDV comme codant pour six ORF dans trois unités de transcription encadrées par des extrémités complémentaires rappelant d'autres virus NNS-RNA[6, 7].
La région codante la plus étendue (ORF V) code pour une protéine prédite d'environ 170 kDa présentant une forte homologie avec la famille des protéines L des polymérases de virus NNS-RNA, plaçant l'ARN polymérase ARN-dépendante virale à l'extrémité 5'-proximale de l'ensemble des gènes dans la disposition canonique des brins négatifs[4]. L'analyse des séquences conservées a identifié l'homologie la plus élevée dans un domaine catalytique putatif avec des résidus invariants et maintenus de manière conservatrice regroupés en quatre motifs hautement conservés (A–D), ce qui est cohérent avec les contraintes enzymatiques conservées sur la fonction polymérase parmi les virus NNS-RNA[18]. Des BDV-RNPs infectieux contenant une seule espèce d'ARN de BDV, l'ARN de 9 kb de polarité négative poly(A)−, ont été rapportés, soutenant que l'ARN poly(A)− de longueur génomique est l'espèce de matrice encapsidée dans les RNP infectieux[13].
Les génomes des bornavirus portent également des régions frontières régulatrices typiques des virus NNS-RNA, avec des ORF flanqués de séquences frontières non traduites qui incluent des signaux d'initiation et d'arrêt de la transcription[8]. Les séquences terminales peuvent s'apparier pour former une structure en forme de panhandle, et chez le BDV, l'alignement des extrémités génomiques a permis la formation d'un panhandle terminal avec les 3 premiers nucléotides non appariés, liant la complémentarité terminale à l'architecture du promoteur sans nécessiter un duplex parfait[5]. Il est important de noter que les analyses des extrémités génomiques du BDV ont rapporté à la fois un manque de complémentarité terminale parfaite et une hétérogénéité accrue des séquences terminales lors d'une persistance à long terme, indiquant que les régions terminales agissant en cis sont variables mais fonctionnellement tolérées à travers les états d'infection[11].
Pour résumer de manière concise l'architecture du génome et de l'expression génique telle que décrite dans ces sources, le tableau ci-dessous contraste plusieurs caractéristiques organisationnelles fréquemment citées.
Transcription et expression génique
L'expression génique des bornavirus chez le BDV comprend plusieurs ARN subgénomiques polyadénylés complémentaires au génome de sens négatif, une étude ayant identifié neuf espèces d'ARN subgénomiques polyadénylés, dont six ARN poly(A)+ polycistroniques et des ARNm monocistroniques correspondant aux ORF I, II et IV[4]. Dans la même analyse, les ARN poly(A)+ monocistroniques pour les ORF III et V n'ont pas été détectés, indiquant que l'expression de certaines régions codantes n'est pas dominée par de simples messages monocistroniques chez le BDV[4]. Les analyses Northern ont également montré que le BDV transcrit des ARN à la fois monocistroniques et polycistroniques et utilise des signaux de terminaison/polyadénylation rappelant d'autres virus à ARN de sens négatif, ce qui est cohérent avec un programme transcriptionnel stop–start qui produit néanmoins une continuité fréquente des transcrits au-delà des sites de terminaison[5].
La terminaison et la polyadénylation impliquent des sites distincts et un signal reconnaissable. Des expériences d'hybridation Northern ont soutenu l'utilisation de sites de terminaison spécifiques (T2, T3, T5 et T7) et ont identifié une séquence consensus de signal de terminaison/polyadénylation, fournissant des points de repère moléculaires pour les limites des transcrits et la propension à la translecture[5]. Le BDV est également remarquable pour une fréquence élevée de transcrits de translecture par rapport à d'autres virus à ARN de sens négatif, ce qui implique que l'efficacité de la terminaison est systématiquement ajustée et peut être mécaniquement essentielle[5]. En effet, la translecture de T3 est essentielle pour l'expression de p190 (protéine polymérase), liant directement la suppression de la terminaison à la disponibilité de la polymérase et donc à la capacité de réplication et de transcription[9].
Les ARNm du BDV sont coiffés et polyadénylés, démontrant que la maturation des ARNm est cohérente avec la production d'ARN aptes à la traduction malgré la niche de réplication nucléaire[19]. Une diversité codante supplémentaire est générée par l'épissage, car les ARN de 2,8 kb et 7,1 kb contiennent deux introns qui sont épissés de manière différentielle pour produire des ARN codant pour plusieurs produits, y compris G et des protéines liées à la polymérase, et des déclarations distinctes indiquent que l'expression de L nécessite l'épissage et la suppression de la terminaison[6, 10]. Au niveau de l'initiation et de la structure du promoteur, une complémentarité terminale parfaite ne semble pas être requise pour une activité de promoteur élevée, et une complémentarité terminale accrue n'a pas favorisé la réplication par rapport à la transcription par la polymérase du BDV, indiquant que l'équilibre réplication-transcription n'est pas simplement une fonction de la force d'appariement des bases terminales[11].
Aperçu du cycle de réplication
La réplication des bornavirus est définie par la synthèse de l'ARN nucléaire et l'organisation nucléaire des RNP virales. Plusieurs sources fournissent des preuves que la réplication et la transcription du BDV se produisent dans le noyau en association avec des BDV-RNPs infectieux, établissant que la matrice fonctionnelle pour la synthèse de l'ARN est un complexe RNP opérant dans l'environnement nucléaire[4, 13]. Des expériences de fractionnement quantitatif et de marquage ont en outre montré que la plupart des ARN de polarité génomique du BDV nouvellement synthétisés sont poly(A)− et nucléaires, soutenant la conclusion selon laquelle la réplication du génome a lieu dans le noyau des cellules infectées[13].
Un modèle de compartimentation cohérent émerge pour les différentes classes d'ARN viral. L'ARN poly(A)− de 9 kb du BDV est largement nucléaire, tandis que les ARN poly(A)+ nouvellement synthétisés sont transportés vers le compartiment cytoplasmique, indiquant que l'exportation des ARNm et la rétention du génome sont séparées à travers l'enveloppe nucléaire[13, 14]. Il a été démontré que le transport des ARNm du BDV est dépendant de l'énergie, ce qui implique un export actif plutôt qu'une diffusion passive comme point de contrôle clé pour l'expression génique dans l'infection par les bornavirus nucléaires[20].
Les bornavirus assemblent également des usines virales nucléaires décrites comme des « speckles de transcrits viraux » (vSPOTs), fournissant un contexte structurel pour une transcription/réplication concentrée et potentiellement un traitement coordonné de l'ARN dans le noyau[1]. Chez le BoDV-1, les vSPOTs formés par la séparation de phases liquide-liquide pilotée par la protéine P sont présents dans le noyau et interagissent étroitement avec la chromatine, y compris l'amarrage sur les cassures double brin de l'ADN neuronal, liant les sites de réplication à des sous-structures nucléaires spécifiques[3]. Conformément à la centralité des RNP, des complexes BDV-RNP contenant uniquement l'espèce d'ARN de 9 kb posséderaient l'activité polymérase requise pour la transcription et porteraient l'information génétique nécessaire pour diriger la synthèse des macromolécules du BDV et la production de particules infectieuses de BDV, reliant les RNP de longueur génomique aux étapes ultérieures du cycle de vie viral[21].
Machinerie RNP et polymérase
L'ARN de longueur génomique du BDV est empaqueté dans des complexes RNP qui contiennent N et le complexe ARN polymérase ARN-dépendante viral, définissant la machinerie centrale comme une matrice de nucléocapside liée par le complexe polymérase[15]. Le complexe RdRp est composé de P et L et est responsable de la réplication et de la transcription du génome viral, établissant L comme la sous-unité catalytique et P comme un cofacteur de polymérase essentiel chez le BDV[15]. Des descriptions structurelles et fonctionnelles définissent en outre L comme une RdRp d'environ 192 kDa formant le cœur du complexe de réplication, effectuant la transcription et la réplication pour produire de l'ARNm viral et de nouvelles copies du génome, et s'associant à P pour une synthèse d'ARN efficace[16].
Les propriétés d'interaction protéique de P fournissent un aperçu mécanistique de la fonction de la polymérase. P s'auto-associe en oligomères via un domaine d'oligomérisation central et sert de pont entre la RdRp et la nucléocapside ; elle sert également de chaperon à N pour la maintenir sous une forme exempte d'ARN nécessaire à la réplication, soutenant un modèle dans lequel P coordonne à la fois le recrutement des enzymes et la préparation de la matrice[3]. De manière cohérente, la perturbation expérimentale de l'oligomérisation de P dans un essai de miniréplicon a permis d'examiner si des mutants de P défectueux pour l'oligomérisation pouvaient reconstituer des complexes polymérase fonctionnels ; aucun des mutants de P n'a soutenu l'expression du rapporteur, indiquant que l'oligomérisation de P est requise pour l'activité polymérase dans ces conditions[22]. De plus, l'activité de cofacteur de P pour la RdRp du BDV est régulée négativement par phosphorylation, fournissant un levier de régulation post-traductionnelle explicite pour la fonction polymérase[15].
Les isoformes de la nucléoprotéine du bornavirus relient également la fonction protéique à la localisation intracellulaire. Des expériences exprimant p40 et p38 ont montré que p40 est principalement nucléaire tandis que p38 est principalement cytoplasmique, pourtant toutes deux lient la phosphoprotéine P du BDV, suggérant qu'une localisation dépendante de l'isoforme couplée à la liaison à P peut moduler le lieu où se produisent l'assemblage et/ou la fonction des RNP[9]. Conformément à un rôle de ciblage nucléaire pour P, P contient un signal de localisation nucléaire (NLS) bipartite fort à son extrémité amino-terminale et des motifs NLS supplémentaires plus faibles, soutenant l'importation nucléaire des complexes contenant la polymérase comme condition préalable mécanistique à la synthèse de l'ARN nucléaire[9].
Enfin, la protéine accessoire X peut directement moduler à la baisse la synthèse d'ARN dans les systèmes reconstitués. Lorsque les complexes polymérase du BDV ont été reconstitués dans des cellules exprimant la protéine X, aucun ARN de minigénome de brin plus n'a été détecté, suggérant que X inhibe à la fois la transcription et la réplication virales dans ce contexte d'essai[23]. Ces observations soutiennent ensemble un modèle de machinerie dans lequel L et P forment le cœur catalytique, l'oligomérisation et la phosphorylation de P régulent la compétence de la polymérase, et des facteurs accessoires tels que X peuvent supprimer la production de la polymérase dans des conditions définies[15, 23].
Trafic nucléaire
Les bornavirus couplent la réplication nucléaire avec un trafic nucléocytoplasmique régulé des composants RNP et des espèces d'ARN. Des preuves directes indiquent que la réplication et la transcription du BDV ont lieu dans les noyaux où des RNPs de BDV infectieux sont présents, et le fractionnement indique que l'ARN de polarité génomique nouvellement synthétisé est fortement enrichi dans la fraction nucléaire, fournissant une impulsion fonctionnelle pour que les voies d'importation et d'exportation nucléaires coordonnent le cycle de vie[13, 21]. Des essais de transport d'ARN indiquent que les ARN poly(A)+ de BDV nouvellement synthétisés sont efficacement transportés vers le compartiment cytoplasmique tandis que l'ARN génomique de 9 kb reste principalement nucléaire, démontrant un comportement d'exportation spécifique à la classe d'ARN[14]. De plus, le transport des ARNm est dépendant de l'énergie, avec un export négligeable en l'absence d'ATP, soutenant des mécanismes d'exportation actifs, dépendants des facteurs de l'hôte pour les ARNm viraux[20].
Pour le trafic des protéines, l'exportation dépendante de CRM1 est impliquée pour la nucléoprotéine. L'exportation nucléaire de N se fait via une voie dépendante de CRM1 compatible avec un NES, et une déclaration distincte rapporte de manière similaire que l'exportation nucléaire de BoDV-N se produit via une voie dépendante de CRM1, indiquant la conservation de cette route d'exportation au sein des bornavirus[15, 24]. Des revues plus larges indiquent en outre que plusieurs protéines du BDV (notamment la nucléoprotéine, la phosphoprotéine, X et L) contribuent au trafic nucléocytoplasmique de la RNP du BDV, et que le contrôle directionnel est probablement déterminé par les ratios et les interactions entre les éléments NLS et NES dans la RNP, cadrant le trafic comme une propriété émergente de signaux de localisation concurrents plutôt que comme un déterminant unique[25].
La formation d'usines virales nucléaires fournit un niveau organisationnel supplémentaire pertinent pour le trafic. Les bornavirus assemblent des vSPOTs dans le noyau, et les vSPOTs de BoDV-1 sont formés par la séparation de phases liquide-liquide pilotée par la protéine P et interagissent étroitement avec la chromatine, ce qui peut contraindre la diffusion et potentiellement diriger le positionnement des sites de transcription/réplication par rapport aux points de repère nucléaires de l'hôte[1, 3].
Génétique inverse et éléments promoteurs
Les signaux de régulation agissant en cis des bornavirus sont concentrés dans les régions frontières et terminales non traduites. Chez le BDV, les ORF sont flanqués de séquences frontières non traduites contenant des signaux régulateurs pour l'initiation et l'arrêt de la transcription, ce qui est cohérent avec une architecture de type Mononegavirales de signaux de début et de fin de gène guidant le comportement de la polymérase le long du génome[8]. Une séquence consensus de début de BDV déduite (UNCNNNUUNN) est identique à celle inférée en comparant les virus NNS-RNA à travers plusieurs familles de Mononegavirales, soutenant la conservation du motif d'initiation utilisé par la machinerie polymérase[4, 17]. Les signaux de terminaison/polyadénylation incluent un hexamère AUUUUU conservé à l'extrémité 5' de chaque signal de terminaison/polyadénylation suivi de GG (ou CG dans l'ORF II), tandis que des signaux putatifs n'ont pas pu être identifiés pour l'ORF III dans une analyse, indiquant à la fois une conservation et des lacunes dans la détectabilité des motifs à travers les frontières des gènes[4].
Les approches de génétique inverse et de minigénome ont testé directement ces éléments régulateurs. Un système ARN polymérase I/polymérase II a été établi pour la reconstitution intracellulaire de la réplication et de la transcription de l'ARN du BDV, permettant une dissection contrôlée des exigences agissant en cis et en trans[11]. Dans ce système, un analogue d'ARN du BDV (minigénome) est synthétisé par l'ARN polymérase I cellulaire et contient des séquences non traduites 5' et 3' agissant en cis du BDV, requises pour la synthèse d'ARN médiée par la polymérase du BDV, liant les régions terminales à la fonction de promoteur dans les cellules[11]. L'encapsidation de l'ARN du minigénome dérivé de la polymérase I par N et P du BDV fournis par plasmide génère une matrice reconnue par la polymérase du BDV reconstituée pour diriger la synthèse d'un ARN antiminigénome de pleine longueur (réplication) et d'un ARNm subgénomique codant pour un gène rapporteur, démontrant expérimentalement que l'encapsidation par N et P est suffisante pour rendre l'ARN apte à la reconnaissance par la polymérase et à la synthèse d'ARN à double rendement[11].
La cartographie du promoteur affine davantage le modèle agissant en cis. Des séquences en aval (nucléotides 25 à 33) étaient nécessaires pour une activité optimale du promoteur, et la délétion des nucléotides 34 à 35 a abrogé l'activité du rapporteur dans ce contexte, identifiant des exigences courtes et spécifiques à la position à proximité du promoteur dans la région du promoteur génomique 3'[12]. Ensemble, ces données soutiennent une architecture de promoteur dans laquelle des séquences terminales compactes et des éléments en aval proches régissent l'initiation et la réplication/transcription productive dans le système polymérase reconstitué[11, 12].
Mécanismes de persistance
La persistance moléculaire des bornavirus est liée à la dynamique des extrémités du génome, à la réplication nucléaire et à l'organisation nucléaire spécialisée. Un processus de « réalignement et élongation » renouvelle les extrémités 3' des molécules de v- et cRNA à partir de matrices internes lors de chaque cycle de réplication et ne peut se produire que si les extrémités sont complètes, fournissant une étape mécanistique explicite qui agit comme un point de contrôle de qualité pour l'intégrité du génome[26]. Ce processus fournit un contrôle qualité intégré qui supprime la réplication des molécules d'ARN présentant des délétions terminales, reliant la logique de réparation des extrémités à la sélection contre les intermédiaires de réplication défectueux[26]. Parallèlement, des analyses des extrémités génomiques au cours d'une infection persistante à long terme ont rapporté un degré plus élevé d'hétérogénéité terminale dans les ARN des cellules infectées de manière persistante par rapport aux points temporels aigus, indiquant que la persistance s'accompagne de changements dans la distribution des variants d'extrémités de génome[11].
La persistance est également associée à un contexte nucléaire stable pour les RNP. Les bornavirus ont été décrits comme étant les seuls parmi les virus NNS-RNA animaux connus à se répliquer et à se transcrire dans le noyau, ce qui fournit le cadre de compartimentation cellulaire pour une synthèse d'ARN non cytolytique à long terme et un traitement nucléaire des extrémités du génome[2]. De plus, le BoDV-1 construit ses vRNPs en utilisant la chromatine de l'hôte comme échafaudage, une propriété qui peut soutenir mécaniquement la persistance dans le noyau en stabilisant le positionnement des vRNP par rapport à la chromatine[27].
La modulation de la réponse de l'hôte a également été liée expérimentalement aux états d'infection. Les cellules infectées par le BDV ont sécrété moins de SEAP que les cellules témoins après activation par Pam3CSK4, suggérant que les cellules infectées par le BDV suppriment activement la signalisation NF-κB, ce qui fournit un corrélat au niveau moléculaire pour l'altération de la signalisation innée pendant l'infection persistante[28].
Questions ouvertes
Plusieurs questions moléculaires restent ouvertes ou se prêtent à une expérimentation ciblée sur la base des découvertes mécanistiques résumées ci-dessus.
- Quels déterminants séquentiels et structurels contrôlent l'efficacité de la terminaison du BDV et la fréquence élevée des transcrits de translecture, en particulier à T3 où la translecture est essentielle pour l'expression de la polymérase[5, 9] ?
- Comment les événements d'épissage alternatif dans les ARN de 2,8 kb et 7,1 kb s'interfacent-ils avec l'utilisation des frontières transcriptionnelles pour produire les stœchiométries correctes de G et de produits liés à la polymérase, y compris les cas où l'expression de L nécessite l'épissage et la suppression de la terminaison[6, 10] ?
- Quelle est la relation quantitative entre l'hétérogénéité terminale observée pendant la persistance et l'activité du promoteur, étant donné qu'une complémentarité terminale parfaite n'est pas requise pour une activité de promoteur élevée et que les extrémités se diversifient lors d'une infection à long terme[11] ?
- Comment l'étape de contrôle qualité de réalignement et élongation est-elle coordonnée avec l'organisation des RNP nucléaires, étant donné que le renouvellement des extrémités 3' dérive de matrices internes et supprime la réplication des ARN à délétion terminale[26] ?
- Quels facteurs de l'hôte et points de repère nucléaires régissent la formation et le positionnement des vSPOTs séparés par phases, pilotés par P, qui interagissent avec la chromatine et s'amarrent sur les cassures double brin de l'ADN neuronal[3] ?
- Comment l'exportation de la nucléoprotéine dépendante de CRM1 et l'exportation des ARNm dépendante de l'énergie s'intègrent-elles pour réguler la compartimentation des ARN poly(A)+ par rapport à l'ARN génomique poly(A)− à travers l'enveloppe nucléaire[13, 15, 20] ?
- Par quel mécanisme moléculaire la protéine X supprime-t-elle l'accumulation d'ARN de minigénome, et comment cette suppression s'articule-t-elle avec la régulation négative de l'activité de cofacteur de polymérase dépendante de la phosphorylation de P[15, 23] ?
