Abstract
Bornavirusser (f.eks. Borna disease virus, BDV; Borna disease virus 1, BoDV-1) er ikke-segmenterede, negative-sense enkeltstrengede RNA-virusser, hvis mest karakteristiske træk blandt animalske ikke-segmenterede negativ-strengs RNA (NNS-RNA) virusser er, at genom-transkription og replikation finder sted i værtscellens kerne frem for overvejende i cytoplasmaet[1–3]. Molekylære studier af BDV har defineret et kompakt ~8,9–9 kb genom med flere åbne læserammer organiseret i et lille antal transkriptionsenheder og flankeret af ekstracistroniske terminale sekvenser, der fungerer som promotere og regulatoriske grænser for viral RNA-syntese[4–8]. Genekspressionen er kompleks og omfatter produktion af både mono- og polycistroniske poly(A)+ RNA'er, hyppig readthrough ved terminationssteder og anvendelse af splejsning til ekspression af nøgleprodukter, herunder polymerasen (L) i visse transkriptkontekster[4–6, 9, 10]. Funktionel rekonstituering og minigenom-systemer har kortlagt cis-agerende promoter-krav i den 3′ genomiske ende og vist, at N og P indkapsler skabeloner, der genkendes af L/P polymerase-komplekset for at generere både replikative og transkriptions-produkter[11, 12]. Nukleær organisering og trafficking former yderligere replikationsprogrammet, hvor virale ”speckles of transcripts” (vSPOTs) og CRM1-afhængig eksport af nukleoprotein bidrager til RNP-dynamik og kompartmentalisering af poly(A)+ over for poly(A)− virale RNA'er[3, 13–15].
Keywords
- Bornavirus[1]
- Borna disease virus[4]
- nonsegmented negative-strand RNA virus[4]
- nuclear replication[2]
- transcription readthrough[5]
- vSPOTs[3]
- minigenome[11]
- CRM1 export[15]
- phosphoprotein P[15]
- RNA-dependent RNA polymerase L[16]
Introduction
Bornavirusser er NNS-RNA virusser, hvis promoter- og gen-start-konsensussekvenser flugter med mønstre observeret på tværs af Mononegavirales-familier, hvilket indikerer en fælles negativ-strengs transkriptionslogik på niveauet for cis-agerende initieringselementer[4, 17]. En central mekanistisk skelnen er, at mens de fleste mononegavirusser hovedsageligt replikerer i cytoplasmaet, replikerer bornavirusser i kernen, hvor de etablerer specialiserede nukleære steder for viral RNA-syntese[1, 3]. Eksperimentel evidens understøtter specifikt, at BDV-replikation og -transkription finder sted i kernerne af inficerede celler og er associeret med infektiøse ribonukleoproteinkomplekser (BDV-RNPs), hvilket understreger, at bornaviral RNA-syntese udføres i konteksten af nukleære RNPs[4, 13]. Nukleær lokalisering understøttes yderligere af cellefraktionering, som viser, at det meste nysyntetiserede genom-polaritets BDV-RNA er poly(A)− og findes i vid udstrækning i den nukleære fraktion, hvilket er i overensstemmelse med nukleær replikation af det genomiske RNA[13].
Genome organization
BDV-genomsekventering og -kortlægning identificerede et lineært ~8,9 kb genom med store åbne læserammer forudsagt over hele genomet og flankeret af ikke-kodende sekvenser ved begge termini[4, 5]. I én rapport blev fem store ORFs (I–V) forudsagt i en 8.903-nt BDV-genomsekvens, mens en anden beskrivelse af BDV-genomet (8.910 nt) tilsvarende noterede antisense-information for fem store ORFs flankeret af 53 nt ikke-kodende sekvens ved 3′-terminus og 91 nt ved 5′-terminus[4, 5]. Ud over de fem ORFs har kortlægning på antigenom-niveau beskrevet tre transkriptionsenheder og seks ORFs, og oversigtsartikler beskriver ligeledes BDV som kodende for seks ORFs i tre transkriptionsenheder indrammet af komplementære termini, der minder om andre NNS RNA-virusser[6, 7].
Det største kodende område (ORF V) koder for et forudsagt ~170 kDa protein med stærk homologi til L-proteinfamilien af NNS-RNA viruspolymeraser, hvilket placerer den virale RNA-afhængige RNA-polymerase i den 5′-proksimale ende af gensættet i det kanoniske negativ-strengs layout[4]. Konserveret sekvensanalyse identificerede højeste homologi i et formodet katalytisk domæne med invariante og konservativt bevarede rester klyngede i fire højt konserverede motiver (A–D), hvilket er i overensstemmelse med konserverede enzymatiske begrænsninger på polymerase-funktion blandt NNS-RNA virusser[18]. Infektiøse BDV-RNPs er rapporteret at indeholde kun én BDV-RNA-art, den poly(A)−, negativ-polaritets 9-kb RNA, hvilket understøtter, at poly(A)− RNA i genomlængde er den indkapslede skabelon-art i infektiøse RNPs[13].
Bornavirus-genomer bærer også regulatoriske grænseregioner, der er typiske for NNS-RNA virusser, med ORFs flankeret af ikke-oversatte grænsesekvenser, der inkluderer transkriptionsinitierings- og stopsignaler[8]. Terminale sekvenser kan baseparre for at danne en panhandle-lignende struktur, og i BDV tillod sammenstillingen af genomiske termini dannelsen af en terminal panhandle med de første 3 nukleotider uparrede, hvilket forbinder terminal komplementaritet til promoter-arkitektur uden at kræve perfekt duplexing[5]. Vigtigt er det, at analyser af BDV genomiske termini har rapporteret både mangel på perfekt terminal komplementaritet og øget terminal sekvensheterogenitet under langvarig persistens, hvilket indikerer, at cis-agerende terminale regioner er variable, men funktionelt tolererede på tværs af infektionstilstande[11].
For kort at opsummere genom- og genekspressionsarkitekturen som beskrevet i disse kilder, kontrasterer tabellen nedenfor flere hyppigt citerede organisatoriske træk.
Transcription and gene expression
Bornavirus-genekspression i BDV omfatter flere polyadenylerede subgenomiske RNA'er, der er komplementære til det negative-sense genom, idet et studie identificerede ni arter af polyadenylerede subgenomiske RNA'er, herunder seks polycistroniske poly(A)+ RNA'er og monocistroniske mRNA'er svarende til ORFs I, II og IV[4]. I samme analyse blev monocistroniske poly(A)+ RNA'er for ORF III og V ikke detekteret, hvilket indikerer, at ekspression af visse kodende regioner ikke domineres af simple monocistroniske budskaber i BDV[4]. Northern-analyser viste også, at BDV transskriberer både mono- og polycistroniske RNA'er og anvender terminations-/polyadenyleringssignaler, der minder om andre negativ-strengs RNA-virusser, i overensstemmelse med et stop–start transkriptionsprogram, der ikke desto mindre giver hyppig transkriptkontinuitet ud over terminationssteder[5].
Terminering og polyadenylering involverer diskrete steder og et genkendeligt signal. Northern-hybridiseringseksperimenter understøttede brugen af specifikke terminationssteder (T2, T3, T5 og T7) og identificerede en konsensussekvens for terminations-/polyadenyleringssignalet, hvilket giver molekylære pejlemærker for transkriptgrænser og readthrough-tilbøjelighed[5]. BDV er også bemærkelsesværdig for en høj frekvens af readthrough-transkripter i forhold til andre negativ-strengs RNA-virusser, hvilket indebærer, at termineringseffektiviteten er systematisk afstemt og kan være mekanistisk essentiel[5]. Faktisk er readthrough af T3 essentiel for ekspression af p190 (polymeraseprotein), hvilket direkte forbinder terminationsundertrykkelse til polymerasetilgængelighed og dermed til kapaciteten for replikation og transkription[9].
BDV mRNA'er er cappede og polyadenylerede, hvilket viser, at mRNA-modning er i overensstemmelse med produktion af translationskompetente RNA'er på trods af den nukleære replikationsniche[19]. Yderligere kodningsdiversitet genereres ved splejsning, da 2,8-kb og 7,1-kb RNA'erne indeholder to introner, der splejses differentielt for at give RNA'er, der koder for flere produkter, herunder G og polymeraserelaterede proteiner, og separate udsagn indikerer, at L-ekspression kræver splejsning og undertrykkelse af terminering[6, 10]. På niveauet for initiering og promoterstruktur ser perfekt terminal komplementaritet ikke ud til at være påkrævet for høj promoteraktivitet, og øget terminal komplementaritet fremmede ikke replikation over for transkription af BDV-polymerasen, hvilket indikerer, at balancen mellem replikation og transkription ikke blot er en funktion af terminal baseparringsstyrke[11].
Replication cycle overview
Bornavirus-replikation er defineret ved nukleær RNA-syntese og nukleær organisering af virale RNPs. Flere kilder giver evidens for, at BDV-replikation og -transkription sker i kernen i forbindelse med infektiøse BDV-RNPs, hvilket fastslår, at den funktionelle skabelon for RNA-syntese er et RNP-kompleks, der opererer i det nukleære miljø[4, 13]. Kvantitative fraktionerings- og mærkningseksperimenter viste yderligere, at det meste nysyntetiserede BDV-genom-polaritets RNA er poly(A)− og nukleært, hvilket understøtter konklusionen om, at genomreplikation finder sted i kernen af inficerede celler[13].
Et konsistent kompartmentaliseringsmønster tegner sig for forskellige virale RNA-klasser. BDV 9-kb poly(A)− RNA er overvejende nukleært, mens nysyntetiserede poly(A)+ RNA'er transporteres til det cytoplasmatiske kompartment, hvilket indikerer, at mRNA-eksport og genom-retention er adskilt på tværs af nukleærmembranen[13, 14]. Transport af BDV mRNA'er er vist at være energiafhængig, hvilket indebærer aktiv eksport frem for passiv diffusion som et centralt kontrolpunkt for genekspression i nukleær bornavirus-infektion[20].
Bornavirusser danner også nukleære virale fabrikker beskrevet som ”viral Speckles Of Transcripts” (vSPOTs), hvilket giver en strukturel kontekst for koncentreret transkription/replikation og potentielt koordineret RNA-processering i kernen[1]. I BoDV-1 er vSPOTs dannet af P-protein-drevet væske-væske-faseseparation til stede i kernen og interagerer tæt med kromatin, herunder docking på neuronale DNA-dobbeltstrengsbrud, hvilket forbinder replikationssteder til specifikke nukleære substrukturer[3]. I overensstemmelse med centraliteten af RNPs er BDV-RNP-komplekser, der kun indeholder 9-kb RNA-arten, rapporteret at besidde den polymeraseaktivitet, der kræves til transkription, og at bære den genetiske information, der er nødvendig for at styre syntesen af BDV-makromolekyler og produktionen af infektiøse BDV-partikler, hvilket forbinder RNPs i genomlængde til efterfølgende trin i den virale livscyklus[21].
RNP and polymerase machinery
BDV-RNA i genomlængde er pakket i RNP-komplekser, der indeholder N og det virale RNA-afhængige RNA-polymerase-kompleks, hvilket definerer kerne-maskineriet som en nukleokapsid-skabelon bundet af polymerase-komplekset[15]. RdRp-komplekset består af P og L og er ansvarlig for replikation og transkription af det virale genom, hvilket etablerer L som den katalytiske underenhed og P som en essentiel polymerase-cofaktor i BDV[15]. Strukturelle og funktionelle beskrivelser definerer yderligere L som en ~192 kDa RdRp, der udgør kernen i replikationskomplekset, udfører transkription og replikation for at producere viralt mRNA og nye genomkopier, og associerer med P for effektiv RNA-syntese[16].
Proteinerinteraktionsegenskaberne for P giver mekanistisk indsigt i polymerase-funktionen. P selvassocierer i oligomerer gennem et centralt oligomeriseringsdomæne og danner bro mellem RdRp og nukleokapsidet, og det fungerer også som chaperon for N for at bevare det i en RNA-fri form, der er nødvendig for replikation, hvilket understøtter en model, hvor P koordinerer både enzymrekruttering og skabelon-parathed[3]. Konsistent hermed adresserede eksperimentel afbrydelse af P-oligomerisering i et minireplikon-assay, om oligomeriserings-defekte P-mutanter kunne rekonstituere funktionelle polymerase-komplekser, og ingen af P-mutanterne understøttede reporter-ekspression, hvilket indikerer, at P-oligomerisering er påkrævet for polymeraseaktivitet under disse forhold[22]. Derudover er cofaktor-aktiviteten af P for BDV-RdRp negativt reguleret af fosforylering, hvilket giver et eksplicit post-translationelt regulatorisk greb til polymerase-funktion[15].
Bornavirus-nukleoprotein-isoformer forbinder også proteinfunktion til intracellulær lokalisering. Eksperimenter med ekspression af p40 og p38 viste, at p40 primært er nukleær, mens p38 primært er cytoplasmatisk, men begge binder BDV-fosfoprotein P, hvilket tyder på, at isoform-afhængig lokalisering koblet med P-binding kan modulere, hvor RNP-samling og/eller funktion finder sted[9]. I overensstemmelse med en nukleær målretningsrolle for P indeholder P et stærkt bipartit nukleært lokaliseringssignal (NLS) ved sin aminoterminus og yderligere svagere NLS-motiver, hvilket understøtter nukleær import af polymerase-indeholdende komplekser som en mekanistisk forudsætning for nukleær RNA-syntese[9].
Endelig kan det accessoriske protein X direkte nedmodulere RNA-syntese i rekonstituerede systemer. Da BDV-polymerase-komplekser blev rekonstitueret i celler, der udtrykte X-protein, blev der ikke detekteret plus-strengs minigenom-RNA, hvilket tyder på, at X hæmmer både viral transkription og replikation i den assay-kontekst[23]. Disse observationer understøtter tilsammen en maskinerimodel, hvor L og P udgør den katalytiske kerne, P-oligomerisering og -fosforylering regulerer polymerase-kompetence, og accessoriske faktorer såsom X kan undertrykke polymerase-output under definerede forhold[15, 23].
Nuclear trafficking
Bornavirusser kobler nukleær replikation med reguleret nukleocytoplasmatisk trafficking af RNP-komponenter og RNA-arter. Direkte evidens indikerer, at BDV-replikation og -transkription finder sted i kerner, hvor infektiøse BDV RNPs er til stede, og fraktionering indikerer, at nysyntetiseret genom-polaritets RNA er stærkt beriget i den nukleære fraktion, hvilket giver en funktionel drivkraft for nukleære import- og eksportveje til at koordinere livscyklussen[13, 21]. RNA-transportassays indikerer, at nysyntetiserede BDV poly(A)+ RNA'er transporteres effektivt til det cytoplasmatiske kompartment, mens 9-kb genomisk RNA forbliver overvejende nukleært, hvilket demonstrerer RNA-klasse-specifik eksportadfærd[14]. Desuden er mRNA-transport energiafhængig, med ubetydelig eksport i fravær af ATP, hvilket understøtter aktive, værtsfaktor-afhængige eksportmekanismer for virale mRNA'er[20].
For protein-trafficking er CRM1-afhængig eksport involveret for nukleoprotein. Den nukleære eksport af N sker via en CRM1-afhængig vej i overensstemmelse med et NES, og et separat udsagn rapporterer tilsvarende, at nukleær eksport af BoDV-N sker via en CRM1-afhængig vej, hvilket indikerer konservering af denne eksportrute inden for bornavirusser[15, 24]. Bredere oversigtsartikler anfører endvidere, at flere BDV-proteiner (herunder nukleoprotein, fosfoprotein, X og L) bidrager til nukleocytoplasmatisk trafficking af BDV RNP, og at den retningsbestemte kontrol sandsynligvis bestemmes af forholdet mellem og interaktionerne af NLS- og NES-elementer i RNP'en, hvilket rammesætter trafficking som en emergent egenskab ved konkurrerende lokaliseringssignaler frem for en enkelt determinant[25].
Dannelsen af nukleære virale fabrikker giver et yderligere trafficking-relevant organisatorisk niveau. Bornavirusser danner vSPOTs i kernen, og BoDV-1 vSPOTs dannes af P-protein-drevet væske-væske-faseseparation og interagerer tæt med kromatin, hvilket kan begrænse diffusion og potentielt styre placeringen af transkriptions-/replikationssteder i forhold til værtens nukleære pejlemærker[1, 3].
Reverse genetics and promoter elements
Bornavirus cis-agerende regulatoriske signaler er koncentreret i ikke-oversatte grænse- og terminalregioner. I BDV er ORFs flankeret af ikke-oversatte grænsesekvenser, der indeholder regulatoriske signaler for transkriptionsinitiering og stop, i overensstemmelse med en Mononegavirales-lignende arkitektur af gen-start- og gen-end-signaler, der styrer polymerasens adfærd langs genomet[8]. En deduceret BDV-start-konsensussekvens (UNCNNNUUNN) er identisk med den, der er udledt ved at sammenligne NNS-RNA-virusser på tværs af flere Mononegavirales-familier, hvilket understøtter konservering af det initieringsmotiv, der anvendes af polymerase-maskineriet[4, 17]. Terminations-/polyadenyleringssignaler inkluderer en konserveret AUUUUU seks-mer i 5′-enden af hvert terminations-/polyadenyleringssignal efterfulgt af GG (eller CG i ORF II), mens formodede signaler ikke kunne identificeres for ORF III i én analyse, hvilket indikerer både konservering og huller i motiv-detekterbarhed på tværs af gengrænser[4].
Reverse-genetics- og minigenom-metoder har direkte testet disse regulatoriske elementer. Et RNA-polymerase I/polymerase II-system blev etableret til intracellulær rekonstituering af BDV-RNA-replikation og -transkription, hvilket muliggør kontrolleret dissektion af cis- og trans-agerende krav[11]. I dette system syntetiseres en BDV-RNA-analog (minigenom) af cellulær RNA-polymerase I og indeholder BDV 5′ og 3′ ikke-oversatte cis-agerende sekvenser, der kræves til BDV-polymerase-medieret RNA-syntese, hvilket forbinder terminale regioner til promoter-funktion i celler[11]. Indkapsling af polymerase I-afledt minigenom-RNA med BDV N og P tilført via plasmid genererer en skabelon, der genkendes af den rekonstituerede BDV-polymerase til at styre syntesen af antiminigenom-RNA i fuld længde (replikation) og et subgenomisk mRNA, der koder for et reportergen, hvilket eksperimentelt demonstrerer, at N- og P-indkapsling er tilstrækkelig til at gøre RNA'et kompetent til polymerase-genkendelse og dual-output RNA-syntese[11].
Promoter-kortlægning forfiner yderligere den cis-agerende model. Downstream-sekvenser (nukleotiderne 25 til 33) var påkrævede for optimal promoteraktivitet, og deletion af nukleotiderne 34 til 35 ophævede reporteraktivitet i denne kontekst, hvilket identificerede korte, positionsspecifikke promoter-proksimale krav i den 3′ genomiske promoter-region[12]. Samlet understøtter disse data en promoter-arkitektur, hvor kompakte terminale sekvenser og nærliggende downstream-elementer styrer initiering og produktiv replikation/transkription i det rekonstituerede polymerase-system[11, 12].
Persistence mechanisms
Bornavirus molekylær persistens er knyttet til genom-ende-dynamik, nukleær replikation og specialiseret nukleær organisering. En ”realign-and-elongation”-proces fornyer 3′-termini af v- og cRNA-molekyler fra interne skabeloner under hver replikationsrunde og kan kun forekomme, hvis termini er komplette, hvilket giver et eksplicit mekanistisk trin, der fungerer som et kvalitetskontrol-checkpoint for genom-integritet[26]. Denne proces giver integreret kvalitetskontrol, der undertrykker replikation af RNA-molekyler med terminale deletioner, hvilket forbinder ende-reparationslogik til selektion mod defekte replikations-intermediater[26]. Sideløbende hermed rapporterede analyser af genomiske termini under langvarig persistent infektion en højere grad af terminal heterogenitet i RNA'er fra persistent inficerede celler sammenlignet med akutte tidspunkter, hvilket indikerer, at persistens ledsages af skift i fordelingen af genom-ende-varianter[11].
Persistens er også associeret med en stabil nukleær kontekst for RNPs. Bornavirusser er beskrevet som værende unikke blandt kendte animalske NNS RNA-virusser ved at replikere og transskribere i kernen, hvilket giver de cellulære kompartment-rammer for langvarig ikke-cytolytisk RNA-syntese og nukleær genom-ende-processering[2]. Derudover opbygger BoDV-1 sine vRNPs ved hjælp af værtskromatin som et stillads, en egenskab der mekanistisk kan understøtte persistens i kernen ved at stabilisere vRNP-positionering i forhold til kromatin[27].
Modulering af værtsrespons er også eksperimentelt blevet knyttet til infektionstilstande. BDV-inficerede celler udskilte mindre SEAP end mock-celler efter Pam3CSK4-aktivering, hvilket tyder på, at BDV-inficerede celler aktivt undertrykker NF-κB-signalering, hvilket giver en molekylær korrelation for ændret medfødt signalering under persistent infektion[28].
Open questions
Flere molekylære spørgsmål forbliver ubesvarede eller er klar til målrettet eksperimentering baseret på de mekanistiske fund, der er opsummeret ovenfor.
- Hvilke sekvensmæssige og strukturelle determinanter kontrollerer BDV-termineringseffektivitet og den høje frekvens af readthrough-transkripter, især ved T3, hvor readthrough er essentiel for polymerase-ekspression[5, 9]?
- Hvordan interagerer alternative splejshændelser i 2,8-kb og 7,1-kb RNA'erne med brugen af transkriptionsgrænser for at give korrekte støkiometrier af G- og polymeraserelaterede produkter, herunder tilfælde hvor L-ekspression kræver splejsning og undertrykkelse af terminering[6, 10]?
- Hvad er det kvantitative forhold mellem terminal heterogenitet observeret under persistens og promoteraktivitet, givet at perfekt terminal komplementaritet ikke er påkrævet for høj promoteraktivitet, og termini diversificeres under langvarig infektion[11]?
- Hvordan koordineres "realign-and-elongation"-kvalitetskontroltrinnet med nukleær RNP-organisering, givet at fornyelse af 3′-termini stammer fra interne skabeloner og undertrykker replikation af terminalt deleterede RNA'er[26]?
- Hvilke værtsfaktorer og nukleære pejlemærker styrer dannelsen og placeringen af P-drevne faseseparerede vSPOTs, der interagerer med kromatin og docker på neuronale DNA-dobbeltstrengsbrud[3]?
- Hvordan integreres CRM1-afhængig eksport af nukleoprotein og energiafhængig mRNA-eksport for at regulere kompartmentaliseringen af poly(A)+ RNA'er over for poly(A)− genomisk RNA på tværs af nukleærmembranen[13, 15, 20]?
- Ved hvilken molekylær mekanisme undertrykker X-protein akkumulering af minigenom-RNA, og hvordan krydser denne undertrykkelse med P-fosforyleringsafhængig negativ regulering af polymerase-cofaktoraktivitet[15, 23]?
