Abstract
Os bornavírus (ex: vírus da doença de Borna, BDV; vírus da doença de Borna 1, BoDV-1) são vírus de RNA de fita simples, sentido negativo, não segmentados, cuja característica mais distinta entre os vírus de RNA de fita negativa não segmentados (NNS-RNA) animais é que a transcrição e a replicação do genoma ocorrem no núcleo da célula hospedeira, em vez de predominantemente no citoplasma[1–3]. Estudos moleculares do BDV definiram um genoma compacto de ~8,9–9 kb com múltiplas janelas de leitura aberta (ORFs) organizadas em um pequeno número de unidades de transcrição e ladeadas por sequências terminais extracistrônicas que funcionam como promotores e limites regulatórios para a síntese de RNA viral[4–8]. A expressão gênica é complexa e inclui a produção de RNAs poli(A)+ mono e policistrônicos, readthrough frequente em sítios de terminação e o uso de splicing para a expressão de produtos essenciais, incluindo a polimerase (L) em alguns contextos de transcritos[4–6, 9, 10]. Sistemas de reconstituição funcional e de minigenoma mapearam os requisitos do promotor de ação cis na extremidade genômica 3' e mostraram que N e P encapsidam moldes reconhecidos pelo complexo polimerase L/P para gerar produtos replicativos e de transcrição[11, 12]. A organização e o tráfego nuclear moldam ainda mais o programa de replicação, com “pontos de transcritos” virais (vSPOTs) e a exportação de nucleoproteína dependente de CRM1 contribuindo para a dinâmica de RNP e a compartimentalização de RNAs virais poli(A)+ versus poli(A)−[3, 13–15].
Keywords
- Bornavirus[1]
- Borna disease virus[4]
- nonsegmented negative-strand RNA virus[4]
- replicação nuclear[2]
- transcription readthrough[5]
- vSPOTs[3]
- minigenoma[11]
- exportação CRM1[15]
- fosfoproteína P[15]
- RNA-dependent RNA polymerase L[16]
Introduction
Os bornavírus são vírus NNS-RNA cujas sequências de consenso de promotor e início de gene se alinham com padrões observados em famílias de Mononegavirales, indicando uma lógica de transcrição de fita negativa compartilhada ao nível de elementos de iniciação de ação cis[4, 17]. Uma distinção mecanística central é que, enquanto a maioria dos mononegavírus replica-se principalmente no citoplasma, os bornavírus replicam-se no núcleo, onde estabelecem sítios nucleares especializados para a síntese de RNA viral[1, 3]. Evidências experimentais apoiam especificamente que a replicação e a transcrição do BDV ocorrem nos núcleos de células infectadas e estão associadas a complexos de ribonucleoproteínas infecciosas (BDV-RNPs), enfatizando que a síntese de RNA bornaviral é executada no contexto de RNPs nucleares[4, 13]. A localização nuclear é reforçada pelo fracionamento celular, mostrando que a maior parte do RNA de BDV de polaridade genômica recém-sintetizado é poli(A)− e encontrado amplamente na fração nuclear, consistente com a replicação nuclear do RNA genômico[13].
Genome organization
O sequenciamento e o mapeamento do genoma do BDV identificaram um genoma linear de ~8,9 kb com as principais janelas de leitura aberta previstas ao longo do genoma e ladeadas por sequências não codificantes em ambos os terminais[4, 5]. Em um relatório, cinco ORFs principais (I–V) foram previstas em uma sequência genômica de BDV de 8.903 nt, enquanto outra descrição do genoma do BDV (8.910 nt) observou de forma semelhante informações antissentido para cinco ORFs principais ladeadas por 53 nt de sequência não codificante no terminal 3' e 91 nt no terminal 5'[4, 5]. Além do enquadramento de cinco ORFs, o mapeamento ao nível do antigenoma descreveu três unidades de transcrição e seis ORFs, e resumos de revisão descrevem igualmente o BDV como codificando seis ORFs em três unidades de transcrição emolduradas por terminais complementares reminiscentes de outros vírus NNS RNA[6, 7].
A maior região codificante (ORF V) codifica uma proteína prevista de ~170 kDa com forte homologia com a família de proteínas L de polimerases de vírus NNS-RNA, situando a RNA-dependent RNA polymerase viral na extremidade 5'-proximal do conjunto de genes no layout canônico de fita negativa[4]. A análise de sequências conservadas identificou a maior homologia em um domínio catalítico putativo com resíduos invariantes e mantidos conservadoramente agrupados em quatro motivos altamente conservados (A–D), consistente com restrições enzimáticas conservadas na função da polimerase entre vírus NNS-RNA[18]. Foi relatado que BDV-RNPs infecciosas contêm apenas uma espécie de RNA de BDV, o RNA de 9 kb de polaridade negativa poli(A)−, sustentando que o RNA poli(A)− de comprimento genômico é a espécie de molde encapsidada em RNPs infecciosas[13].
Os genomas de bornavírus também carregam regiões de limite regulatório típicas de vírus NNS-RNA, com ORFs ladeadas por sequências de limite não traduzidas que incluem sinais de iniciação e parada de transcrição[8]. As sequências terminais podem se emparelhar para formar uma estrutura semelhante a uma alça (panhandle) e, no BDV, o alinhamento dos terminais genômicos permitiu a formação de um panhandle terminal com os primeiros 3 nucleotídeos não emparelhados, ligando a complementaridade terminal à arquitetura do promotor sem exigir um duplex perfeito[5]. Importante ressaltar que análises dos terminais genômicos do BDV relataram tanto a falta de complementaridade terminal perfeita quanto o aumento da heterogeneidade da sequência terminal durante a persistência a longo prazo, indicando que as regiões terminais de ação cis são variáveis, porém funcionalmente toleradas em diferentes estados de infecção[11].
Para resumir concisamente a arquitetura do genoma e da expressão gênica conforme descrito nessas fontes, a tabela abaixo contrasta várias características organizacionais frequentemente citadas.
Transcription and gene expression
A expressão gênica bornaviral no BDV inclui múltiplos RNAs subgenômicos poliadenilados complementares ao genoma de sentido negativo, com um estudo identificando nove espécies de RNAs subgenômicos poliadenilados, incluindo seis RNAs poli(A)+ policistrônicos e mRNAs monocistrônicos correspondentes às ORFs I, II e IV[4]. Na mesma análise, RNAs poli(A)+ monocistrônicos para as ORFs III e V não foram detectados, indicando que a expressão de algumas regiões codificantes não é dominada por simples mensagens monocistrônicas no BDV[4]. Análises de Northern também mostraram que o BDV transcreve RNAs tanto mono quanto policistrônicos e utiliza sinais de terminação/poliadenilação reminiscentes de outros vírus de RNA de fita negativa, consistente com um programa transcricional stop–start que, no entanto, resulta em uma frequência contínua de transcritos além dos sítios de terminação[5].
A terminação e a poliadenilação envolvem sítios discretos e um sinal reconhecível. Experimentos de hibridização Northern apoiaram o uso de sítios de terminação específicos (T2, T3, T5 e T7) e identificaram uma sequência de consenso de sinal de terminação/poliadenilação, fornecendo marcos moleculares para os limites dos transcritos e a propensão ao readthrough[5]. O BDV também é notável por uma alta frequência de transcritos de readthrough em relação a outros vírus de RNA de fita negativa, implicando que a eficiência de terminação é sistematicamente ajustada e pode ser mecanisticamente essencial[5]. De fato, o readthrough de T3 é essencial para a expressão de p190 (proteína polimerase), ligando diretamente a supressão da terminação à disponibilidade da polimerase e, portanto, à capacidade de replicação e transcrição[9].
Os mRNAs do BDV são capeados e poliadenilados, demonstrando que a maturação do mRNA é consistente com a produção de RNAs competentes para tradução, apesar do nicho de replicação nuclear[19]. Diversidade codificante adicional é gerada por splicing, visto que os RNAs de 2,8 kb e 7,1 kb contêm dois íntrons que sofrem splicing diferencial para gerar RNAs que codificam múltiplos produtos, incluindo G e proteínas relacionadas à polimerase; declarações separadas indicam que a expressão de L requer splicing e supressão de terminação[6, 10]. Ao nível da iniciação e da estrutura do promotor, a complementaridade terminal perfeita não parece ser necessária para uma alta atividade do promotor, e o aumento da complementaridade terminal não promoveu a replicação versus transcrição pela polimerase do BDV, indicando que o equilíbrio replicação-transcrição não é simplesmente uma função da força de emparelhamento de bases terminais[11].
Replication cycle overview
A replicação dos bornavírus é definida pela síntese de RNA nuclear e pela organização nuclear de RNPs virais. Múltiplas fontes fornecem evidências de que a replicação e a transcrição do BDV ocorrem no núcleo em associação com BDV-RNPs infecciosas, estabelecendo que o molde funcional para a síntese de RNA é um complexo RNP operando no ambiente nuclear[4, 13]. Experimentos de fracionamento quantitativo e marcação mostraram ainda que a maioria do RNA de polaridade genômica do BDV recém-sintetizado é poli(A)− e nuclear, apoiando a conclusão de que a replicação do genoma ocorre no núcleo das células infectadas[13].
Um padrão consistente de compartimentalização emerge para diferentes classes de RNA viral. O RNA poli(A)− de 9 kb do BDV é amplamente nuclear, enquanto os RNAs poli(A)+ recém-sintetizados são transportados para o compartimento citoplasmático, indicando que a exportação de mRNA e a retenção do genoma são separadas através do envelope nuclear[13, 14]. O transporte de mRNAs do BDV demonstrou ser dependente de energia, implicando uma exportação ativa em vez de difusão passiva como um ponto de controle fundamental para a expressão gênica na infecção por bornavírus nuclear[20].
Os bornavírus também montam fábricas virais nucleares descritas como “pontos de transcritos virais” (vSPOTs), fornecendo um contexto estrutural para transcrição/replicação concentrada e processamento de RNA potencialmente coordenado no núcleo[1]. No BoDV-1, os vSPOTs formados pela separação de fases líquido-líquido impulsionada pela proteína P estão presentes no núcleo e interagem estreitamente com a cromatina, incluindo a ancoragem em quebras de fita dupla de DNA neuronal, ligando os sítios de replicação a subestruturas nucleares específicas[3]. Consistente com a centralidade das RNPs, complexos BDV-RNP contendo apenas a espécie de RNA de 9 kb foram relatados como possuindo a atividade de polimerase necessária para a transcrição e portadores da informação genética necessária para direcionar a síntese de macromoléculas do BDV e a produção de partículas infecciosas do BDV, conectando RNPs de comprimento genômico a etapas subsequentes no ciclo de vida viral[21].
RNP and polymerase machinery
O RNA de comprimento genômico do BDV é empacotado em complexos RNP que contêm N e o complexo RNA-dependent RNA polymerase viral, definindo o maquinário central como um molde de nucleocapsídeo ligado pelo complexo polimerase[15]. O complexo RdRp consiste em P e L e é responsável pela replicação e transcrição do genoma viral, estabelecendo L como a subunidade catalítica e P como um cofator essencial da polimerase no BDV[15]. Descrições estruturais e funcionais definem ainda L como uma RdRp de ~192 kDa que forma o núcleo do complexo de replicação, realizando a transcrição e a replicação para produzir mRNA viral e novas cópias do genoma, e associando-se a P para uma síntese de RNA eficiente[16].
As propriedades de interação proteica de P fornecem informações mecanísticas sobre a função da polimerase. P autoassocia-se em oligômeros através de um domínio de oligomerização central e faz a ponte entre a RdRp e o nucleocapsídeo, além de atuar como chaperone de N para mantê-la em uma forma livre de RNA necessária para a replicação, apoiando um modelo no qual P coordena tanto o recrutamento da enzima quanto a prontidão do molde[3]. Consistentemente, a interrupção experimental da oligomerização de P em um ensaio de minireplicon abordou se mutantes de P com defeito de oligomerização poderiam reconstituir complexos de polimerase funcionais, e nenhum dos mutantes de P sustentou a expressão do repórter, indicando que a oligomerização de P é necessária para a atividade da polimerase sob essas condições[22]. Além disso, a atividade de cofator de P para a RdRp do BDV é regulada negativamente por fosforilação, fornecendo uma alavanca regulatória pós-traducional explícita para a função da polimerase[15].
Isoformas da nucleoproteína de bornavírus também conectam a função proteica à localização intracelular. Experimentos expressando p40 e p38 mostraram que p40 é primariamente nuclear, enquanto p38 é primariamente citoplasmática, no entanto, ambas se ligam à fosfoproteína P do BDV, sugerindo que a localização dependente da isoforma acoplada à ligação de P pode modular onde ocorre a montagem e/ou função da RNP[9]. Consistente com um papel de direcionamento nuclear para P, esta contém um forte sinal de localização nuclear (NLS) bipartido em seu amino-terminal e motivos NLS adicionais mais fracos, apoiando a importação nuclear de complexos contendo polimerase como um pré-requisito mecanístico para a síntese de RNA nuclear[9].
Finalmente, a proteína acessória X pode modular diretamente a síntese de RNA em sistemas reconstituídos. Quando complexos de polimerase de BDV foram reconstituídos em células que expressam a proteína X, nenhum RNA de minigenoma de fita positiva foi detectado, sugerindo que X inibe tanto a transcrição quanto a replicação viral naquele contexto de ensaio[23]. Essas observações juntas apoiam um modelo de maquinário no qual L e P formam o núcleo catalítico, a oligomerização e a fosforilação de P regulam a competência da polimerase, e fatores acessórios como X podem suprimir a produção da polimerase sob condições definidas[15, 23].
Nuclear trafficking
Os bornavírus acoplam a replicação nuclear com o tráfego nucleocitoplasmático regulado de componentes de RNP e espécies de RNA. Evidências diretas indicam que a replicação e a transcrição do BDV ocorrem em núcleos onde as RNPs infecciosas do BDV estão presentes, e o fracionamento indica que o RNA de polaridade genômica recém-sintetizado é fortemente enriquecido na fração nuclear, fornecendo um ímpeto funcional para que as vias de importação e exportação nuclear coordenem o ciclo de vida[13, 21]. Ensaios de transporte de RNA indicam que os RNAs poli(A)+ do BDV recém-sintetizados são eficientemente transportados para o compartimento citoplasmático, enquanto o RNA genômico de 9 kb permanece majoritariamente nuclear, demonstrando um comportamento de exportação específico da classe de RNA[14]. Além disso, o transporte de mRNA é dependente de energia, com exportação insignificante na ausência de ATP, apoiando mecanismos de exportação ativos e dependentes de fatores do hospedeiro para mRNAs virais[20].
Para o tráfego de proteínas, a exportação dependente de CRM1 está implicada para a nucleoproteína. A exportação nuclear de N ocorre através de uma via dependente de CRM1 consistente com um NES, e uma declaração separada relata de forma semelhante que a exportação nuclear de BoDV-N ocorre via uma via dependente de CRM1, indicando a conservação desta rota de exportação dentro dos bornavírus[15, 24]. Revisões mais amplas afirmam ainda que várias proteínas do BDV (incluindo nucleoproteína, fosfoproteína, X e L) contribuem para o tráfego nucleocitoplasmático da RNP do BDV, e que o controle direcional é provavelmente determinado pelas proporções e interações entre os elementos NLS e NES na RNP, enquadrando o tráfego como uma propriedade emergente de sinais de localização concorrentes em vez de um determinante único[25].
A formação de fábricas virais nucleares fornece um nível organizacional adicional relevante para o tráfego. Os bornavírus montam vSPOTs no núcleo, e os vSPOTs de BoDV-1 são formados pela separação de fases líquido-líquido impulsionada pela proteína P e interagem estreitamente com a cromatina, o que pode restringir a difusão e potencialmente direcionar o posicionamento dos sítios de transcrição/replicação em relação aos marcos nucleares do hospedeiro[1, 3].
Reverse genetics and promoter elements
Os sinais regulatórios de ação cis dos bornavírus estão concentrados em regiões terminais e de limites não traduzidas. No BDV, as ORFs são ladeadas por sequências de limites não traduzidas contendo sinais regulatórios para a iniciação e parada da transcrição, consistente com uma arquitetura do tipo Mononegavirales de sinais de início e fim de gene orientando o comportamento da polimerase ao longo do genoma[8]. Uma sequência de consenso de início de BDV deduzida (UNCNNNUUNN) é idêntica à inferida pela comparação de vírus NNS-RNA em múltiplas famílias de Mononegavirales, apoiando a conservação do motivo de iniciação usado pelo maquinário da polimerase[4, 17]. Os sinais de terminação/poliadenilação incluem um hexâmero AUUUUU conservado na extremidade 5' de cada sinal de terminação/poliadenilação seguido por GG (ou CG na ORF II), enquanto sinais putativos não puderam ser identificados para a ORF III em uma análise, indicando tanto a conservação quanto lacunas na detectabilidade do motivo através dos limites dos genes[4].
Abordagens de genética reversa e minigenoma testaram diretamente esses elementos regulatórios. Um sistema de RNA polimerase I/polimerase II foi estabelecido para a reconstituição intracelular da replicação e transcrição do RNA do BDV, permitindo a dissecação controlada dos requisitos de ação cis e trans[11]. Neste sistema, um análogo de RNA do BDV (minigenoma) é sintetizado pela RNA polimerase I celular e contém as sequências de ação cis não traduzidas 5' e 3' do BDV necessárias para a síntese de RNA mediada pela polimerase do BDV, ligando as regiões terminais à função do promotor nas células[11]. A encapsidação do RNA do minigenoma derivado da polimerase I pelas proteínas N e P do BDV fornecidas por plasmídeo gera um molde reconhecido pela polimerase do BDV reconstituída para direcionar a síntese de RNA antiminigenoma de comprimento total (replicação) e um mRNA subgenômico que codifica um gene repórter, demonstrando experimentalmente que a encapsidação por N e P é suficiente para tornar o RNA competente para o reconhecimento pela polimerase e para a síntese de RNA de saída dupla[11].
O mapeamento do promotor refina ainda mais o modelo de ação cis. Sequências a jusante (nucleotídeos 25 a 33) foram necessárias para a atividade ideal do promotor, e a deleção dos nucleotídeos 34 a 35 anulou a atividade do repórter neste contexto, identificando requisitos proximais ao promotor curtos e específicos de posição na região do promotor genômico 3'[12]. Juntos, esses dados apoiam uma arquitetura de promotor na qual sequências terminais compactas e elementos próximos a jusante governam a iniciação e a replicação/transcrição produtiva no sistema de polimerase reconstituído[11, 12].
Persistence mechanisms
A persistência molecular dos bornavírus está ligada à dinâmica das extremidades do genoma, à replicação nuclear e à organização nuclear especializada. Um processo de "realign-and-elongation" renova os terminais 3' das moléculas de v- e cRNA a partir de moldes internos durante cada rodada de replicação e só pode ocorrer se os terminais estiverem completos, fornecendo uma etapa mecanística explícita que atua como um ponto de verificação de controle de qualidade para a integridade do genoma[26]. Este processo fornece um controle de qualidade integrado que suprime a replicação de moléculas de RNA com deleções terminais, conectando a lógica de reparo de extremidades à seleção contra intermediários de replicação defeituosos[26]. Paralelamente, análises de terminais genômicos durante a infecção persistente a longo prazo relataram um maior grau de heterogeneidade terminal em RNAs de células persistentemente infectadas em comparação com pontos de tempo agudos, indicando que a persistência é acompanhada por mudanças na distribuição de variantes de extremidade do genoma[11].
A persistência também está associada a um contexto nuclear estável para as RNPs. Os bornavírus foram descritos como únicos entre os vírus animais NNS RNA conhecidos por replicarem e transcreverem no núcleo, o que fornece o cenário de compartimentalização celular para a síntese de RNA não citolítica a longo prazo e o processamento nuclear das extremidades do genoma[2]. Além disso, o BoDV-1 constrói suas vRNPs usando a cromatina do hospedeiro como arcabouço, uma propriedade que pode apoiar mecanisticamente a persistência no núcleo ao estabilizar o posicionamento da vRNP em relação à cromatina[27].
A modulação da resposta do hospedeiro também foi ligada experimentalmente aos estados de infecção. Células infectadas pelo BDV secretaram menos SEAP do que as células de controle após a ativação por Pam3CSK4, sugerindo que as células infectadas pelo BDV suprimem ativamente a sinalização NF-κB, o que fornece um correlato em nível molecular para a sinalização inata alterada durante a infecção persistente[28].
Open questions
Várias questões moleculares permanecem em aberto ou estão posicionadas para experimentação direcionada com base nos achados mecanísticos resumidos acima.
- Quais determinantes estruturais e de sequência controlam a eficiência de terminação do BDV e a alta frequência de transcritos de readthrough, particularmente em T3, onde o readthrough é essencial para a expressão da polimerase[5, 9]?
- Como os eventos de splicing alternativo nos RNAs de 2,8 kb e 7,1 kb fazem interface com o uso de limites transcricionais para gerar estequiometrias corretas de G e produtos relacionados à polimerase, incluindo casos em que a expressão de L requer splicing e supressão de terminação[6, 10]?
- Qual é a relação quantitativa entre a heterogeneidade terminal observada durante a persistência e a atividade do promotor, visto que a complementaridade terminal perfeita não é necessária para uma alta atividade do promotor e os terminais se diversificam durante a infecção a longo prazo[11]?
- Como a etapa de controle de qualidade de realign-and-elongation é coordenada com a organização da RNP nuclear, visto que a renovação dos terminais 3' deriva de moldes internos e suprime a replicação de RNAs com deleção terminal[26]?
- Quais fatores do hospedeiro e marcos nucleares governam a formação e o posicionamento dos vSPOTs separados por fases impulsionados por P que interagem com a cromatina e se ancoram em quebras de fita dupla de DNA neuronal[3]?
- Como a exportação de nucleoproteína dependente de CRM1 e a exportação de mRNA dependente de energia se integram para regular a compartimentalização de RNAs poli(A)+ versus RNA genômico poli(A)− através do envelope nuclear[13, 15, 20]?
- Por qual mecanismo molecular a proteína X suprime o acúmulo de RNA do minigenoma, e como essa supressão se cruza com a regulação negativa da atividade do cofator da polimerase dependente da fosforilação de P[15, 23]?
