Аннотация
Bornaviruses (например, Borna disease virus, BDV; Borna disease virus 1, BoDV-1) представляют собой несегментированные одноцепочечные РНК-вирусы отрицательной полярности, чьей наиболее отличительной особенностью среди несегментированных вирусов животных с РНК отрицательной полярности (NNS-RNA) является то, что транскрипция и репликация генома происходят в ядре клетки-хозяина, а не преимущественно в цитоплазме[1–3]. Молекулярные исследования BDV позволили описать компактный геном размером около 8,9–9 kb с множественными открытыми рамками считывания, организованными в небольшое количество единиц транскрипции и фланкированными экстрацистронными терминальными последовательностями, которые функционируют как промоторы и регуляторные границы для синтеза вирусной РНК[4–8]. Экспрессия генов носит сложный характер и включает продукцию как моно-, так и полицистронных поли(A)+ РНК, частое сквозное считывание в сайтах терминации и использование сплайсинга для экспрессии ключевых продуктов, включая полимеразу (L) в некоторых контекстах транскриптов[4–6, 9, 10]. Системы функциональной реконституции и минигеномные системы позволили картировать требования к цис-действующим промоторам на 3′-конце генома и показали, что N и P инкапсидируют матрицы, распознаваемые полимеразным комплексом L/P для генерации как репликативных, так и транскрипционных продуктов[11, 12]. Ядерная организация и траффик дополнительно формируют программу репликации, при этом вирусные «спеклы транскриптов» (vSPOTs) и CRM1-зависимый экспорт нуклеопротеина способствуют динамике RNP и компартментализации поли(A)+ по сравнению с поли(A)− вирусными РНК[3, 13–15].
Ключевые слова
- Bornavirus[1]
- Borna disease virus[4]
- несегментированный вирус с РНК отрицательной полярности[4]
- ядерная репликация[2]
- сквозное считывание транскрипции[5]
- vSPOTs[3]
- минигеном[11]
- CRM1-экспорт[15]
- фосфопротеин P[15]
- РНК-зависимая РНК-полимераза L[16]
Введение
Bornaviruses — это NNS-RNA вирусы, чьи промоторные и консенсусные последовательности начала гена соответствуют паттернам, наблюдаемым в семействах порядка Mononegavirales, что указывает на общую логику транскрипции отрицательной цепи на уровне цис-действующих элементов инициации[4, 17]. Центральным механистическим отличием является то, что в то время как большинство мононегавирусов реплицируются в основном в цитоплазме, борнавирусы реплицируются в ядре, где они создают специализированные ядерные участки для синтеза вирусной РНК[1, 3]. Экспериментальные данные подтверждают, что репликация и транскрипция BDV происходят в ядрах инфицированных клеток и связаны с инфекционными рибонуклеопротеиновыми комплексами (BDV-RNPs), что подчеркивает выполнение синтеза борнавирусной РНК в контексте ядерных RNP[4, 13]. Ядерная локализация дополнительно подтверждается фракционированием клеток, показывающим, что большая часть вновь синтезированной РНК BDV геномной полярности является поли(A)− и обнаруживается в основном в ядерной фракции, что согласуется с ядерной репликацией геномной РНК[13].
Организация генома
Секвенирование и картирование генома BDV выявило линейный геном размером около 8,9 kb с основными открытыми рамками считывания, предсказанными по всему геному и фланкированными некодирующими последовательностями на обоих концах[4, 5]. В одном отчете было предсказано пять основных ORF (I–V) в последовательности генома BDV длиной 8 903 nt, в то время как в другом описании генома BDV (8 910 nt) аналогичным образом отмечалось наличие антисмысловой информации для пяти основных ORF, фланкированных 53 nt некодирующей последовательности на 3′-конце и 91 nt на 5′-конце[4, 5]. В дополнение к структуре из пяти ORF, картирование на уровне антигенома описало три единицы транскрипции и шесть ORF, и обзорные резюме также описывают BDV как кодирующий шесть ORF в трех единицах транскрипции, обрамленных комплементарными концами, напоминающими другие NNS-RNA вирусы[6, 7].
Самая большая кодирующая область (ORF V) кодирует предсказанный белок массой около 170 kDa с сильной гомологией семейству L-белков полимераз NNS-RNA вирусов, что помещает вирусную РНК-зависимую РНК-полимеразу на 5′-проксимальный конец набора генов в канонической структуре отрицательной цепи[4]. Консервативный анализ последовательностей выявил самую высокую гомологию в предполагаемом каталитическом домене с инвариантными и консервативно сохраняемыми остатками, сгруппированными в четыре высококонсервативных мотива (A–D), что согласуется с консервативными ферментативными ограничениями функции полимеразы среди NNS-RNA вирусов[18]. Сообщалось, что инфекционные BDV-RNPs содержат только один вид РНК BDV — поли(A)− РНК отрицательной полярности размером 9 kb, что подтверждает, что полноразмерная геномная поли(A)− РНК является инкапсидированным матричным видом в инфекционных RNP[13].
Геномы борнавирусов также несут регуляторные пограничные области, типичные для NNS-RNA вирусов, с ORF, фланкированными нетранслируемыми пограничными последовательностями, которые включают сигналы инициации и остановки транскрипции[8]. Терминальные последовательности могут образовывать пары оснований с созданием структуры типа «рукоятки», и у BDV выравнивание геномных концов позволило сформировать терминальную «рукоятку» с первыми 3 неспаренными нуклеотидами, связывая терминальную комплементарность с архитектурой промотора без необходимости идеального дуплексирования[5]. Важно отметить, что анализ геномных концов BDV выявил как отсутствие идеальной терминальной комплементарности, так и повышенную гетерогенность терминальных последовательностей во время длительной персистенции, что указывает на вариабельность цис-действующих терминальных областей, которые, тем не менее, функционально допускаются в различных состояниях инфекции[11].
Чтобы кратко суммировать архитектуру генома и экспрессии генов, описанную в этих источниках, в таблице ниже сопоставлены несколько часто цитируемых организационных особенностей.
Транскрипция и экспрессия генов
Экспрессия генов борнавируса у BDV включает несколько полиаденилированных субгеномных РНК, комплементарных геному отрицательной полярности, при этом в одном исследовании было выявлено девять видов полиаденилированных субгеномных РНК, включая шесть полицистронных поли(A)+ РНК и моноцистронные мРНК, соответствующие ORF I, II и IV[4]. В том же анализе моноцистронные поли(A)+ РНК для ORF III и V не были обнаружены, что указывает на то, что в экспрессии некоторых кодирующих областей BDV не доминируют простые моноцистронные сообщения[4]. Нозерн-анализ также показал, что BDV транскрибирует как моно-, так и полицистронные РНК и использует сигналы терминации/полиаденилирования, напоминающие другие вирусы с РНК отрицательной полярности, что согласуется с транскрипционной программой типа «стоп-старт», которая, тем не менее, обеспечивает частую непрерывность транскрипта за пределами сайтов терминации[5].
Терминация и полиаденилирование включают дискретные сайты и узнаваемый сигнал. Эксперименты по Нозерн-гибридизации подтвердили использование специфических сайтов терминации (T2, T3, T5 и T7) и идентифицировали консенсусную последовательность сигнала терминации/полиаденилирования, обеспечивающую молекулярные ориентиры для границ транскриптов и склонности к сквозному считыванию[5]. BDV также примечателен высокой частотой сквозного считывания транскриптов по сравнению с другими вирусами с РНК отрицательной полярности, что подразумевает систематическую настройку эффективности терминации, которая может быть механистически необходимой[5]. Действительно, сквозное считывание T3 необходимо для экспрессии p190 (белка полимеразы), что напрямую связывает подавление терминации с доступностью полимеразы и, следовательно, со способностью к репликации и транскрипции[9].
мРНК BDV кэпированы и полиаденилированы, что демонстрирует соответствие созревания мРНК продукции трансляционно-компетентных РНК, несмотря на ядерную нишу репликации[19]. Дополнительное разнообразие кодирования создается за счет сплайсинга, так как РНК размером 2,8 kb и 7,1 kb содержат два интрона, которые подвергаются дифференциальному сплайсингу с получением РНК, кодирующих несколько продуктов, включая G и белки, связанные с полимеразой; отдельные данные указывают на то, что экспрессия L требует сплайсинга и подавления терминации[6, 10]. На уровне инициации и структуры промотора идеальная терминальная комплементарность, по-видимому, не требуется для высокой активности промотора, а повышенная терминальная комплементарность не способствовала репликации по сравнению с транскрипцией полимеразой BDV, что указывает на то, что баланс репликации и транскрипции не является простой функцией силы терминального спаривания оснований[11].
Обзор цикла репликации
Репликация борнавируса определяется ядерным синтезом РНК и ядерной организацией вирусных RNP. Множество источников предоставляют доказательства того, что репликация и транскрипция BDV происходят в ядре в ассоциации с инфекционными BDV-RNPs, устанавливая, что функциональной матрицей для синтеза РНК является комплекс RNP, работающий в ядерной среде[4, 13]. Эксперименты по количественному фракционированию и мечению дополнительно показали, что большая часть вновь синтезированной РНК BDV геномной полярности является поли(A)− и ядерной, что подтверждает вывод о том, что репликация генома происходит в ядре инфицированных клеток[13].
Для различных классов вирусной РНК выявляется последовательная закономерность компартментализации. РНК BDV размером 9 kb поли(A)− находится в основном в ядре, в то время как вновь синтезированные поли(A)+ РНК транспортируются в цитоплазматический компартмент, что указывает на разделение экспорта мРНК и удержания генома через ядерную оболочку[13, 14]. Было показано, что транспорт мРНК BDV является энергозависимым, что подразумевает активный экспорт, а не пассивную диффузию в качестве ключевой точки контроля экспрессии генов при ядерной борнавирусной инфекции[20].
Борнавирусы также собирают ядерные вирусные фабрики, описываемые как «вирусные спеклы транскриптов» (vSPOTs), обеспечивающие структурный контекст для концентрированной транскрипции/репликации и потенциально скоординированного процессинга РНК в ядре[1]. У BoDV-1 vSPOTs, образованные за счет жидкостно-жидкостного разделения фаз, управляемого белком P, присутствуют в ядре и тесно взаимодействуют с хроматином, включая стыковку с двухцепочечными разрывами ДНК нейронов, связывая сайты репликации со специфическими ядерными субструктурами[3]. В соответствии с центральной ролью RNP, сообщалось, что комплексы BDV-RNP, содержащие только вид РНК размером 9 kb, обладают полимеразной активностью, необходимой для транскрипции, и несут генетическую информацию, необходимую для управления синтезом макромолекул BDV и продукции инфекционных частиц BDV, связывая полноразмерные геномные RNP с последующими этапами жизненного цикла вируса[21].
RNP и полимеразный аппарат
Полноразмерная геномная РНК BDV упакована в RNP-комплексы, содержащие N и комплекс вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы, что определяет основной аппарат как нуклеокапсидную матрицу, связанную с полимеразным комплексом[15]. Комплекс RdRp состоит из P и L и отвечает за репликацию и транскрипцию вирусного генома, утверждая L в качестве каталитической субъединицы, а P — в качестве важного кофактора полимеразы у BDV[15]. Структурные и функциональные описания далее определяют L как RdRp массой около 192 kDa, формирующую ядро репликационного комплекса, осуществляющую транскрипцию и репликацию для продукции вирусной мРНК и новых копий генома, и взаимодействующую с P для эффективного синтеза РНК[16].
Свойства взаимодействия белков P дают механистическое понимание функции полимеразы. P самоассоциируется в олигомеры через центральный домен олигомеризации и связывает RdRp и нуклеокапсид, а также выступает в роли шаперона для N, поддерживая его в свободной от РНК форме, необходимой для репликации, что подтверждает модель, в которой P координирует как привлечение фермента, так и готовность матрицы[3]. Согласуется с этим то, что экспериментальное нарушение олигомеризации P в анализе с минирепликоном было направлено на выяснение того, могут ли мутанты P с дефектом олигомеризации восстанавливать функциональные полимеразные комплексы; ни один из мутантов P не поддерживал экспрессию репортера, что указывает на необходимость олигомеризации P для активности полимеразы в этих условиях[22]. Кроме того, кофакторная активность P для RdRp BDV негативно регулируется фосфорилированием, обеспечивая явный посттрансляционный регуляторный рычаг для функции полимеразы[15].
Изоформы нуклеопротеина борнавируса также связывают функцию белка с внутриклеточной локализацией. Эксперименты по экспрессии p40 и p38 показали, что p40 является преимущественно ядерным, тогда как p38 — преимущественно цитоплазматическим, однако оба связывают фосфопротеин P BDV, что позволяет предположить, что изоформозависимая локализация в сочетании со связыванием P может модулировать место сборки и/или функционирования RNP[9]. В соответствии с ролью P в ядерном таргетинге, P содержит сильный двухкомпонентный сигнал ядерной локализации (NLS) на своем амино-конце и дополнительные более слабые мотивы NLS, что поддерживает ядерный импорт комплексов, содержащих полимеразу, как механистическую предпосылку для ядерного синтеза РНК[9].
Наконец, вспомогательный белок X может напрямую снижать синтез РНК в реконструированных системах. Когда полимеразные комплексы BDV были реконструированы в клетках, экспрессирующих белок X, плюс-цепи РНК минигенома обнаружено не было, что позволяет предположить, что X ингибирует как вирусную транскрипцию, так и репликацию в условиях этого анализа[23]. Эти наблюдения в совокупности подтверждают модель аппарата, в которой L и P образуют каталитическое ядро, олигомеризация и фосфорилирование P регулируют компетенцию полимеразы, а вспомогательные факторы, такие как X, могут подавлять выход полимеразы при определенных условиях[15, 23].
Ядерный траффик
Борнавирусы сочетают ядерную репликацию с регулируемым нуклеоцитоплазматическим траффиком компонентов RNP и видов РНК. Прямые доказательства указывают на то, что репликация и транскрипция BDV происходят в ядрах, где присутствуют инфекционные BDV RNP, а фракционирование показывает, что вновь синтезированная РНК геномной полярности сильно обогащена в ядерной фракции, что обеспечивает функциональный стимул для путей ядерного импорта и экспорта для координации жизненного цикла[13, 21]. Тесты на транспорт РНК показывают, что вновь синтезированные поли(A)+ РНК BDV эффективно транспортируются в цитоплазматический компартмент, в то время как геномная РНК размером 9 kb остается в основном ядерной, демонстрируя специфическое для класса РНК поведение при экспорте[14]. Более того, транспорт мРНК является энергозависимым, с ничтожно малым экспортом в отсутствие ATP, что подтверждает активные, зависимые от факторов хозяина механизмы экспорта вирусных мРНК[20].
Что касается транспорта белков, то для нуклеопротеина предполагается CRM1-зависимый экспорт. Ядерный экспорт N осуществляется через CRM1-зависимый путь, соответствующий NES, и в отдельном заявлении аналогично сообщается, что ядерный экспорт BoDV-N происходит через CRM1-зависимый путь, что указывает на консервативность этого маршрута экспорта у борнавирусов[15, 24]. В более широких обзорах далее утверждается, что несколько белков BDV (включая нуклеопротеин, фосфопротеин, X и L) вносят вклад в нуклеоцитоплазматический траффик BDV RNP, и что направленный контроль, вероятно, определяется соотношением и взаимодействием элементов NLS и NES в RNP, представляя траффик как эмерджентное свойство конкурирующих сигналов локализации, а не как единственный определяющий фактор[25].
Формирование ядерных вирусных фабрик обеспечивает дополнительный организационный уровень, имеющий отношение к траффику. Борнавирусы собирают vSPOTs в ядре, причем vSPOTs BoDV-1 образуются за счет жидкостно-жидкостного разделения фаз, управляемого белком P, и тесно взаимодействуют с хроматином, что может ограничивать диффузию и потенциально направлять позиционирование сайтов транскрипции/репликации относительно ядерных ориентиров хозяина[1, 3].
Обратная генетика и промоторные элементы
Цис-действующие регуляторные сигналы борнавируса сосредоточены в нетранслируемых пограничных и терминальных областях. У BDV ORF фланкированы нетранслируемыми пограничными последовательностями, содержащими регуляторные сигналы для инициации и остановки транскрипции, что согласуется с архитектурой Mononegavirales, где сигналы начала и конца гена направляют поведение полимеразы вдоль генома[8]. Выведенная консенсусная последовательность старта BDV (UNCNNNUUNN) идентична той, что была получена путем сравнения NNS-RNA вирусов из нескольких семейств Mononegavirales, что подтверждает консервативность мотива инициации, используемого полимеразным аппаратом[4, 17]. Сигналы терминации/полиаденилирования включают консервативный шестичлен AUUUUU на 5′-конце каждого сигнала терминации/полиаденилирования, за которым следует GG (или CG в ORF II), в то время как предполагаемые сигналы не могли быть идентифицированы для ORF III в одном из анализов, что указывает как на консервативность, так и на пробелы в обнаруживаемости мотивов на границах генов[4].
Методы обратной генетики и минигеномов позволили напрямую протестировать эти регуляторные элементы. Система РНК-полимеразы I/полимеразы II была создана для внутриклеточной реконституции репликации и транскрипции РНК BDV, что позволило провести контролируемый анализ цис- и транс-действующих требований[11]. В этой системе аналог РНК BDV (минигеном) синтезируется клеточной РНК-полимеразой I и содержит 5′- и 3′-нетранслируемые цис-действующие последовательности BDV, необходимые для опосредованного полимеразой BDV синтеза РНК, связывая терминальные области с функцией промотора в клетках[11]. Инкапсидация РНК минигенома, полученной с помощью полимеразы I, белками BDV N и P, поставляемыми плазмидами, генерирует матрицу, распознаваемую реконструированной полимеразой BDV для управления синтезом полноразмерной антиминигеномной РНК (репликация) и субгеномной мРНК, кодирующей репортерный ген, что экспериментально доказывает достаточность инкапсидации N и P для того, чтобы сделать РНК компетентной для распознавания полимеразой и синтеза РНК с двойным выходом[11].
Картирование промотора дополнительно уточняет цис-действующую модель. Последовательности ниже по течению (нуклеотиды 25–33) были необходимы для оптимальной активности промотора, а делеция нуклеотидов 34–35 отменяла активность репортера в этом контексте, выявляя короткие, специфичные для позиции проксимальные требования к промотору в области 3′-геномного промотора[12]. Вместе эти данные подтверждают архитектуру промотора, в которой компактные терминальные последовательности и близлежащие элементы ниже по течению управляют инициацией и продуктивной репликацией/транскрипцией в системе реконструированной полимеразы[11, 12].
Механизмы персистенции
Молекулярная персистенция борнавируса связана с динамикой концов генома, ядерной репликацией и специализированной ядерной организацией. Процесс «перевыравнивания и элонгации» обновляет 3′-концы молекул v- и cRNA с внутренних матриц во время каждого раунда репликации и может происходить только в том случае, если концы полные, обеспечивая явный механистический этап, который действует как контрольная точка качества целостности генома[26]. Этот процесс обеспечивает интегрированный контроль качества, который подавляет репликацию молекул РНК с терминальными делециями, связывая логику восстановления концов с отбором против дефектных интермедиатов репликации[26]. Параллельно, анализ геномных концов при длительной персистентной инфекции выявил более высокую степень терминальной гетерогенности в РНК из персистентно инфицированных клеток по сравнению с острыми временными точками, что указывает на то, что персистенция сопровождается изменениями в распределении вариантов концов генома[11].
Персистенция также связана со стабильным ядерным контекстом для RNP. Борнавирусы были описаны как уникальные среди известных животных NNS-RNA вирусов, реплицирующиеся и транскрибирующиеся в ядре, что обеспечивает клеточную компартментализацию для долгосрочного нецитолитического синтеза РНК и процессинга концов ядерного генома[2]. Кроме того, BoDV-1 строит свои vRNP, используя хроматин хозяина в качестве каркаса, — свойство, которое может механистически поддерживать персистенцию в ядре путем стабилизации позиционирования vRNP относительно хроматина[27].
Модуляция ответа хозяина также была экспериментально связана с состояниями инфекции. Клетки, инфицированные BDV, секретировали меньше SEAP, чем контрольные клетки после активации Pam3CSK4, что позволяет предположить, что инфицированные BDV клетки активно подавляют сигнализацию NF-κB, обеспечивая молекулярный коррелят для изменения врожденной сигнализации во время персистентной инфекции[28].
Открытые вопросы
Несколько молекулярных вопросов остаются открытыми или подготовлены для целевых экспериментов на основе механистических выводов, обобщенных выше.
- Какие последовательные и структурные детерминанты контролируют эффективность терминации BDV и высокую частоту сквозного считывания транскриптов, особенно на T3, где сквозное считывание необходимо для экспрессии полимеразы[5, 9]?
- Как события альтернативного сплайсинга в РНК 2,8 kb и 7,1 kb взаимодействуют с использованием границ транскрипции для получения правильной стехиометрии G и продуктов, связанных с полимеразой, включая случаи, когда экспрессия L требует сплайсинга и подавления терминации[6, 10]?
- Какова количественная связь между терминальной гетерогенностью, наблюдаемой при персистенции, и активностью промотора, учитывая, что идеальная терминальная комплементарность не требуется для высокой активности промотора, а концы диверсифицируются во время длительной инфекции[11]?
- Как этап контроля качества «перевыравнивания и элонгации» координируется с ядерной организацией RNP, учитывая, что обновление 3′-концов происходит на основе внутренних матриц и подавляет репликацию РНК с терминальными делециями[26]?
- Какие факторы хозяина и ядерные ориентиры управляют формированием и позиционированием фазово-разделенных vSPOTs, управляемых белком P, которые взаимодействуют с хроматином и стыкуются с двухцепочечными разрывами ДНК нейронов[3]?
- Как CRM1-зависимый экспорт нуклеопротеина и энергозависимый экспорт мРНК интегрируются для регулирования компартментализации поли(A)+ РНК по сравнению с поли(A)− геномной РНК через ядерную оболочку[13, 15, 20]?
- По какому молекулярному механизму белок X подавляет накопление РНК минигенома и как это подавление пересекается с фосфорилирование-зависимой негативной регуляцией активности кофактора полимеразы белком P[15, 23]?
