Abstract
Bornavirus (f.eks. Borna disease virus, BDV; Borna disease virus 1, BoDV-1) er ikke-segmenterte, negativ-sense enkeltstrenget RNA-virus hvis mest karakteristiske trekk blant ikke-segmenterte negative-strand RNA-virus (NNS-RNA) hos dyr er at genomtranskripsjon og replikasjon foregår i vertscellens kjerne i stedet for hovedsakelig i cytoplasmaet[1–3]. Molekylære studier av BDV har definert et kompakt ~8,9–9 kb genom med flere åpne leserammer (ORFs) organisert i et lite antall transkripsjonsenheter og flankert av ekstracistroniske terminale sekvenser som fungerer som promotere og regulatoriske grenser for viral RNA-syntese[4–8]. Genuttrykket er komplekst og inkluderer produksjon av både mono- og polycistroniske poly(A)+ RNA-er, hyppig readthrough ved termineringsseter, og bruk av spleising for uttrykk av nøkkelprodukter, inkludert polymerasen (L) i enkelte transkripsjonskontekster[4–6, 9, 10]. Funksjonell rekonstituering og minigenomsystemer har kartlagt cis-agerende promoterbehov i den 3′ genomiske enden og vist at N og P innkapsler maler som gjenkjennes av L/P-polymerasekomplekset for å generere både replikative og transkriperte produkter[11, 12]. Nukleær organisering og trafikk utformer replikasjonsprogrammet ytterligere, der virale «speckles of transcripts» (vSPOTs) og CRM1-avhengig eksport av nukleoprotein bidrar til RNP-dynamikk og kompartmentalisering av poly(A)+ versus poly(A)− virale RNA-er[3, 13–15].
Keywords
- Bornavirus[1]
- Borna disease virus[4]
- nonsegmented negative-strand RNA virus[4]
- nuclear replication[2]
- transcription readthrough[5]
- vSPOTs[3]
- minigenome[11]
- CRM1 export[15]
- phosphoprotein P[15]
- RNA-dependent RNA polymerase L[16]
Introduction
Bornavirus er NNS-RNA-virus hvis promoter- og genstart-konsensussekvenser samsvarer med mønstre observert på tvers av Mononegavirales-familier, noe som indikerer en delt negativ-strand transkripsjonslogikk på nivået for cis-agerende initieringselementer[4, 17]. En sentral mekanistisk forskjell er at mens de fleste mononegavirus hovedsakelig replikerer i cytoplasmaet, replikerer bornavirus i kjernen, hvor de etablerer spesialiserte nukleære seter for viral RNA-syntese[1, 3]. Eksperimentell evidens støtter spesifikt at BDV-replikasjon og transkripsjon finner sted i kjernene til infiserte celler og er assosiert med infeksiøse ribonukleoprotein-komplekser (BDV-RNPs), noe som understreker at bornaviral RNA-syntese utføres i sammenheng med nukleære RNPs[4, 13]. Nukleær lokalisering støttes ytterligere av cellefraksjonering som viser at det meste av nysyntetisert BDV-RNA med genomisk polaritet er poly(A)− og finnes i stor grad i den nukleære fraksjonen, i samsvar med nukleær replikasjon av det genomiske RNA-et[13].
Genome organization
Genomsekvensering og kartlegging av BDV identifiserte et lineært ~8,9 kb genom med store åpne leserammer forutsagt over hele genomet og flankert av ikke-kodende sekvenser ved begge termini[4, 5]. I én rapport ble fem store ORFs (I–V) forutsagt i en BDV-genomsekvens på 8 903 nt, mens en annen beskrivelse av BDV-genomet (8 910 nt) på tilsvarende måte bemerket antisense-informasjon for fem store ORFs flankert av 53 nt ikke-kodende sekvens ved 3′-terminus og 91 nt ved 5′-terminus[4, 5]. I tillegg til rammen med fem ORFs, har kartlegging på antigenom-nivå beskrevet tre transkripsjonsenheter og seks ORFs, og oppsummeringer på oversiktsnivå beskriver på samme måte at BDV koder for seks ORFs i tre transkripsjonsenheter flankert av komplementære termini som minner om andre NNS-RNA-virus[6, 7].
Den største kodende regionen (ORF V) koder for et forutsagt protein på ~170 kDa med sterk homologi til L-proteinfamilien av NNS-RNA-viruspolymeraser, noe som plasserer den virale RNA-avhengige RNA-polymerasen i den 5′-proksimale enden av gensettet i det kanoniske negativ-strand-oppsettet[4]. Konservert sekvensanalyse identifiserte høyest homologi i et antatt katalytisk domene med invariante og konservativt opprettholdte rester gruppert i fire høykonserverte motiver (A–D), i samsvar med konserverte enzymatiske begrensninger på polymerasefunksjon blant NNS-RNA-virus[18]. Infeksiøse BDV-RNPs har blitt rapportert å inneholde kun én BDV-RNA-art, det poly(A)−, negativ-polaritets 9-kb RNA-et, noe som støtter at genom-lengde poly(A)− RNA er den innkapslede mal-arten i infeksiøse RNPs[13].
Bornavirusgenomer bærer også regulatoriske grenseregioner typiske for NNS-RNA-virus, med ORFs flankert av ikke-oversatte grensesekvenser som inkluderer signaler for transkripsjonsinitiering og stopp[8]. Terminale sekvenser kan basepare for å danne en «panhandle»-lignende struktur, og i BDV tillot justeringen av genomiske termini dannelsen av en terminal panhandle der de tre første nukleotidene var uparet, noe som kobler terminal komplementaritet til promoterarkitektur uten å kreve perfekt dupleksdannelse[5]. Viktigst er det at analyser av BDV-genomiske termini rapporterte både mangel på perfekt terminal komplementaritet og økt terminal sekvensheterogenitet under langsiktig persistens, noe som indikerer at cis-agerende terminale regioner er variable, men funksjonelt tolerert på tvers av infeksjonstilstander[11].
For å kortfattet oppsummere genom- og genuttrykksarkitektur som beskrevet i disse kildene, kontrasterer tabellen nedenfor flere ofte siterte organisatoriske trekk.
Transcription and gene expression
Bornavirus-genuttrykk i BDV inkluderer flere polyadenylerte subgenomiske RNA-er komplementære til det negativ-sense genomet, der en studie identifiserte ni arter av polyadenylerte subgenomiske RNA-er, inkludert seks polycistroniske poly(A)+ RNA-er og monocistroniske mRNA-er tilsvarende ORF I, II og IV[4]. I den samme analysen ble monocistroniske poly(A)+ RNA-er for ORF III og V ikke detektert, noe som indikerer at uttrykket av visse kodende regioner ikke domineres av enkle monocistroniske beskjeder i BDV[4]. Northern-analyser viste også at BDV transkriberer både mono- og polycistroniske RNA-er og bruker terminerings-/polyadenyleringssignaler som minner om andre negativ-strand RNA-virus, i samsvar med et stopp–start transkripsjonsprogram som likevel gir hyppig transkriptkontinuitet utover termineringsseter[5].
Terminering og polyadenylering involverer diskrete seter og et gjenkjennelig signal. Northern-hybridiseringseksperimenter støttet bruken av spesifikke termineringsseter (T2, T3, T5 og T7) og identifiserte en konsensussekvens for terminerings-/polyadenyleringssignaler, noe som gir molekylære landemerker for transkriptgrenser og tilbøyelighet for readthrough[5]. BDV er også bemerkelsesverdig for en høy frekvens av readthrough-transkripter sammenlignet med andre negativ-strand RNA-virus, noe som innebærer at termineringseffektiviteten er systematisk avstemt og kan være mekanistisk essensiell[5]. Faktisk er readthrough av T3 essensiell for uttrykk av p190 (polymeraseprotein), noe som direkte kobler termineringssuppresjon til polymerasetilgjengelighet og dermed til kapasiteten for replikasjon og transkripsjon[9].
BDV-mRNA-er er cappa og polyadenylerte, noe som demonstrerer at mRNA-modning er konsistent med produksjon av translasjonskompetente RNA-er til tross for den nukleære replikasjonsnisjen[19]. Ytterligere kodende mangfold genereres ved spleising, ettersom 2,8-kb og 7,1-kb RNA-ene inneholder to introner som spleises differensielt for å gi RNA-er som koder for flere produkter inkludert G og polymeraserelaterte proteiner, og separate utsagn indikerer at L-uttrykk krever spleising og suppresjon av terminering[6, 10]. På nivået for initiering og promoterstruktur ser det ikke ut til at perfekt terminal komplementaritet er nødvendig for høy promoteraktivitet, og økt terminal komplementaritet fremmet ikke replikasjon versus transkripsjon av BDV-polymerasen, noe som indikerer at balansen mellom replikasjon og transkripsjon ikke bare er en funksjon av terminal baseparingsstyrke[11].
Replication cycle overview
Bornavirusreplikasjon defineres av nukleær RNA-syntese og nukleær organisering av virale RNPs. Flere kilder gir bevis for at BDV-replikasjon og transkripsjon foregår i kjernen i assosiasjon med infeksiøse BDV-RNPs, noe som fastslår at den funksjonelle malen for RNA-syntese er et RNP-kompleks som opererer i det nukleære miljøet[4, 13]. Kvantitative fraksjonerings- og merkingseksperimenter viste videre at det meste av nysyntetisert BDV-genomisk polaritets-RNA er poly(A)− og nukleært, noe som støtter konklusjonen om at genomreplikasjon finner sted i kjernen til infiserte celler[13].
Et konsistent kompartmentaliseringsmønster fremtrer for ulike virale RNA-klasser. BDV 9-kb poly(A)− RNA er i stor grad nukleært, mens nysyntetiserte poly(A)+ RNA-er transporteres til det cytoplasmatiske kompartmentet, noe som indikerer at mRNA-eksport og genomretensjon er separert over kjernemembranen[13, 14]. Transport av BDV-mRNA-er har vist seg å være energiavhengig, noe som innebærer aktiv eksport snarere enn passiv diffusjon som et viktig kontrollpunkt for genuttrykk ved nukleær bornavirusinfeksjon[20].
Bornavirus samler også nukleære virale fabrikker beskrevet som «viral Speckles Of Transcripts» (vSPOTs), som gir en strukturell kontekst for konsentrert transkripsjon/replikasjon og potensielt koordinert RNA-prosessering i kjernen[1]. I BoDV-1 er vSPOTs, dannet av P-proteindrevet væske–væske-faseseparasjon, til stede i kjernen og interagerer tett med kromatin, inkludert dokking på nevronale DNA-dobbeltstrandbrudd, noe som kobler replikasjonsseter til spesifikke nukleære substrukturer[3]. I samsvar med sentraliteten til RNPs har BDV-RNP-komplekser som kun inneholder 9-kb RNA-arten blitt rapportert å besitte polymeraseaktivitet som kreves for transkripsjon, og å bære den genetiske informasjonen som trengs for å styre syntese av BDV-makromolekyler og produksjon av infeksiøse BDV-partikler, noe som kobler genom-lengde RNPs til nedstrøms trinn i den virale livssyklusen[21].
RNP and polymerase machinery
BDV-genom-lengde RNA er pakket inn i RNP-komplekser som inneholder N og det virale RNA-avhengige RNA-polymerasekomplekset, noe som definerer kjernemaskineriet som en nukleokapsid-mal bundet av polymerasekomplekset[15]. RdRp-komplekset består av P og L og er ansvarlig for replikasjon og transkripsjon av det virale genomet, noe som etablerer L som den katalytiske underenheten og P som en essensiell polymerase-kofaktor i BDV[15]. Strukturelle og funksjonelle beskrivelser definerer videre L som en ~192 kDa RdRp som danner kjernen i replikasjonskomplekset, utfører transkripsjon og replikasjon for å produsere viralt mRNA og nye genomkopier, og assosierer med P for effektiv RNA-syntese[16].
Proteinteraksjonsegenskapene til P gir mekanistisk innsikt i polymerasefunksjonen. P selv-assosierer i oligomerer gjennom et sentralt oligomeriseringsdomene og brobygger RdRp og nukleokapsid, og det fungerer også som sjaperong for N for å opprettholde det i en RNA-fri form som trengs for replikasjon, noe som støtter en modell der P koordinerer både enzymrekruttering og mal-beredskap[3]. Konsistent med dette ble det ved eksperimentell forstyrrelse av P-oligomerisering i et minireplikon-assay undersøkt om oligomeriserings-defekte P-mutanter kunne rekonstituere funksjonelle polymerasekomplekser, og ingen av P-mutantene støttet reporteruttrykk, noe som indikerer at P-oligomerisering er nødvendig for polymeraseaktivitet under disse forholdene[22]. I tillegg reguleres kofaktoraktiviteten til P for BDV RdRp negativt av fosforilering, noe som gir en eksplisitt post-translasjonell regulatorisk spak for polymerasefunksjon[15].
Bornavirus-nukleoprotein-isoformer kobler også proteinfunksjon til intracellulær lokalisering. Eksperimenter som uttrykte p40 og p38 viste at p40 primært er nukleært mens p38 primært er cytoplasmatisk, men begge binder BDV-fosfoproteinet P, noe som tyder på at isoform-avhengig lokalisering koblet med P-binding kan modulere hvor RNP-montering og/eller funksjon forekommer[9]. I samsvar med en nukleær målrettingsrolle for P, inneholder P et sterkt bipartitt nukleært lokaliseringssignal (NLS) ved sin amino-terminus og ytterligere svakere NLS-motiver, noe som støtter nukleær import av polymerase-holdige komplekser som en mekanistisk forutsetning for nukleær RNA-syntese[9].
Til slutt kan aksessorproteinet X direkte nedregulere RNA-syntese i rekonstituerte systemer. Når BDV-polymerasekomplekser ble rekonstituert i celler som uttrykte X-protein, ble ingen pluss-strand minigenom-RNA detektert, noe som tyder på at X hemmer både viral transkripsjon og replikasjon i den assay-konteksten[23]. Disse observasjonene støtter sammen en maskinerimodell der L og P danner den katalytiske kjernen, P-oligomerisering og fosforilering regulerer polymerasekompetanse, og aksessoriske faktorer som X kan undertrykke polymerase-output under definerte forhold[15, 23].
Nuclear trafficking
Bornavirus kobler nukleær replikasjon med regulert nukleocytoplasmatisk trafikk av RNP-komponenter og RNA-arter. Direkte bevis indikerer at BDV-replikasjon og transkripsjon finner sted i kjerner hvor infeksiøse BDV RNPs er til stede, og fraksjonering indikerer at nysyntetisert genomisk polaritets-RNA er sterkt anriket i den nukleære fraksjonen, noe som gir en funksjonell drivkraft for nukleær import- og eksportveier for å koordinere livssyklusen[13, 21]. RNA-transport-assays indikerer at nysyntetiserte BDV poly(A)+ RNA-er transporteres effektivt til det cytoplasmatiske kompartmentet mens 9-kb genomisk RNA forblir hovedsakelig nukleært, noe som demonstrerer RNA-klassespesifikk eksportadferd[14]. Videre er mRNA-transport energiavhengig, med ubetydelig eksport i fravær av ATP, noe som støtter aktive, vertsfaktor-avhengige eksportmekanismer for virale mRNA-er[20].
For proteintrafikk er CRM1-avhengig eksport implisert for nukleoprotein. Den nukleære eksporten av N skjer via en CRM1-avhengig vei i samsvar med et NES, og et separat utsagn rapporterer på tilsvarende måte at nukleær eksport av BoDV-N skjer via en CRM1-avhengig vei, noe som indikerer konservering av denne eksportruten innen bornavirus[15, 24]. Bredere oversikter fastslår videre at flere BDV-proteiner (inkludert nukleoprotein, fosfoprotein, X og L) bidrar til nukleocytoplasmatisk trafikk av BDV RNP, og at retningskontroll sannsynligvis bestemmes av forholdet og interaksjonene mellom NLS- og NES-elementer i RNP-en, noe som rammer inn trafikk som en egenskap som fremtrer fra konkurrerende lokaliseringssignaler snarere enn en enkelt determinant[25].
Dannelse av nukleære virale fabrikker gir et ytterligere organisatorisk nivå relevant for trafikk. Bornavirus samler vSPOTs i kjernen, og BoDV-1 vSPOTs dannes av P-proteindrevet væske–væske-faseseparasjon og interagerer tett med kromatin, noe som kan begrense diffusjon og potensielt styre posisjoneringen av transkripsjons-/replikasjonsseter i forhold til vertens nukleære landemerker[1, 3].
Reverse genetics and promoter elements
Bornavirus cis-agerende regulatoriske signaler er konsentrert i ikke-oversatte grense- og terminalregioner. I BDV er ORFs flankert av ikke-oversatte grensesekvenser som inneholder regulatoriske signaler for transkripsjonsinitiering og stopp, i samsvar med en Mononegavirales-lignende arkitektur av genstart- og genslutt-signaler som styrer polymeraseadferd langs genomet[8]. En dedusert BDV-startkonsensussekvens (UNCNNNUUNN) er identisk med den som er utledet ved å sammenligne NNS-RNA-virus på tvers av flere Mononegavirales-familier, noe som støtter konservering av initieringsmotivet som brukes av polymerasemaskineriet[4, 17]. Terminerings-/polyadenyleringssignaler inkluderer en konservert AUUUUU seks-mer ved 5′-enden av hvert terminerings-/polyadenyleringssignal etterfulgt av GG (eller CG i ORF II), mens antatte signaler ikke kunne identifiseres for ORF III i én analyse, noe som indikerer både konservering og gap i detekterbarhet av motiver på tvers av gengrenser[4].
Revers-genetiske og minigenom-tilnærminger har testet disse regulatoriske elementene direkte. Et RNA polymerase I/polymerase II-system ble etablert for intracellulær rekonstituering av BDV RNA-replikasjon og transkripsjon, noe som muliggjør kontrollert dissekering av cis- og trans-agerende krav[11]. I dette systemet syntetiseres en BDV-RNA-analog (minigenom) av cellulær RNA polymerase I og inneholder BDV 5′ og 3′ ikke-oversatte cis-agerende sekvenser som kreves for BDV polymerase-mediert RNA-syntese, noe som kobler terminale regioner til promoterfunksjon i celler[11]. Innkapsling av polymerase I-derivert minigenom-RNA med plastmid-levert BDV N og P genererer en mal som gjenkjennes av den rekonstituerte BDV-polymerasen for å styre syntese av full-lengde antiminigenom-RNA (replikasjon) og et subgenomisk mRNA som koder for et reportergen, noe som eksperimentelt demonstrerer at N- og P-innkapsling er tilstrekkelig for å gjøre RNA-et kompetent for polymeraserenkjennelse og RNA-syntese med dobbelt utbytte[11].
Promoterkartlegging foredler ytterligere den cis-agerende modellen. Nedstrøms sekvenser (nukleotidene 25 til 33) var nødvendige for optimal promoteraktivitet, og delesjon av nukleotidene 34 til 35 opphevet reporteraktivitet i denne konteksten, noe som identifiserte korte, posisjonsspesifikke promoter-proksimale krav i den 3′ genomiske promoterregionen[12]. Samlet støtter disse dataene en promoterarkitektur der kompakte terminale sekvenser og nærliggende nedstrøms elementer styrer initiering og produktiv replikasjon/transkripsjon i det rekonstituerte polymerasesystemet[11, 12].
Persistence mechanisms
Molekylær persistens hos bornavirus er knyttet til genomende-dynamikk, nukleær replikasjon og spesialisert nukleær organisering. En «realign-and-elongation»-prosess fornyer 3′-termini til v- og cRNA-molekyler fra interne maler under hver replikasjonsrunde og kan bare skje hvis termini er komplette, noe som gir et eksplisitt mekanistisk trinn som fungerer som et kvalitetskontrollpunkt for genomintegritet[26]. Denne prosessen gir integrert kvalitetskontroll som undertrykker replikasjon av RNA-molekyler med terminale delesjoner, og kobler endereparasjonslogikk til seleksjon mot defekte replikasjonsintermediater[26]. Parallelt rapporterte analyser av genomiske termini under langsiktig persistent infeksjon en høyere grad av terminal heterogenitet i RNA fra persistent infiserte celler sammenlignet med akutte tidspunkter, noe som indikerer at persistens ledsages av skift i distribusjonen av genomende-varianter[11].
Persistens er også assosiert med en stabil nukleær kontekst for RNPs. Bornavirus har blitt beskrevet som unike blant kjente NNS-RNA-virus hos dyr ved at de replikerer og transkriberer i kjernen, noe som gir den cellulære kompartment-innstillingen for langsiktig ikke-cytolytisk RNA-syntese og nukleær genomende-prosessering[2]. I tillegg konstruerer BoDV-1 sine vRNPs ved å bruke vertens kromatin som et stillas, en egenskap som mekanistisk kan støtte persistens i kjernen ved å stabilisere vRNP-posisjonering i forhold til kromatin[27].
Modulering av vertrespons har også blitt eksperimentelt koblet til infeksjonstilstander. BDV-infiserte celler sekrerte mindre SEAP enn mock-celler etter Pam3CSK4-aktivering, noe som tyder på at BDV-infiserte celler aktivt undertrykker NF-κB-signalering, noe som gir et molekylært korrelat for endret medfødt signalering under persistent infeksjon[28].
Open questions
Flere molekylære spørsmål forblir åpne eller er posisjonert for målrettet eksperimentering basert på de mekanistiske funnene oppsummert ovenfor.
- Hvilke sekvens- og strukturdeterminanter kontrollerer BDV-termineringseffektivitet og den høye frekvensen av readthrough-transkripter, spesielt ved T3 der readthrough er essensiell for polymeraseuttrykk[5, 9]?
- Hvordan interagerer alternative spleisehendelser i 2,8-kb og 7,1-kb RNA-ene med bruken av transkripsjonelle grenser for å gi riktig støkiometri av G- og polymeraserelaterte produkter, inkludert tilfeller der L-uttrykk krever spleising og suppresjon av terminering[6, 10]?
- Hva er det kvantitative forholdet mellom terminal heterogenitet observert under persistens og promoteraktivitet, gitt at perfekt terminal komplementaritet ikke er nødvendig for høy promoteraktivitet og termini diversifiseres under langsiktig infeksjon[11]?
- Hvordan koordineres kvalitetskontrolltrinnet for «realign-and-elongation» med nukleær RNP-organisering, gitt at 3′-termini-fornyelse stammer fra interne maler og undertrykker replikasjon av RNA med terminale delesjoner[26]?
- Hvilke vertsfaktorer og nukleære landemerker styrer dannelsen og posisjoneringen av P-drevne faseseparerte vSPOTs som interagerer med kromatin og dokker på nevronale DNA-dobbeltstrandbrudd[3]?
- Hvordan integreres CRM1-avhengig eksport av nukleoprotein og energiavhengig mRNA-eksport for å regulere kompartmentaliseringen av poly(A)+ RNA-er versus poly(A)− genomisk RNA over kjernemembranen[13, 15, 20]?
- Ved hvilken molekylær mekanisme undertrykker X-protein akkumulering av minigenom-RNA, og hvordan krysser denne undertrykkelsen med P-fosforyleringsavhengig negativ regulering av polymerase-kofaktoraktivitet[15, 23]?
