Abstract
Bornavirus (t.ex. Borna disease virus, BDV; Borna disease virus 1, BoDV-1) är icke-segmenterade, enkelsträngade RNA-virus med negativ polaritet vars mest distinkta egenskap bland icke-segmenterade negativsträngade RNA-virus (NNS-RNA) hos djur är att genomtranskription och replikation sker i värdcellens kärna snarare än i huvudsak i cytoplasman[1–3]. Molekylära studier av BDV har definierat ett kompakt genom på ~8,9–9 kb med flera öppna läsramar organiserade i ett litet antal transkriptionsenheter och flankerade av extracistroniska terminala sekvenser som fungerar som promotorer och regulatoriska gränser för viral RNA-syntes[4–8]. Genuttrycket är komplext och inkluderar produktion av både mono- och polycistroniska poly(A)+ RNA:er, frekvent readthrough vid termineringsställen samt användning av splitsning för uttryck av nyckelprodukter, inklusive polymeraset (L) i vissa transkriptionskontexter[4–6, 9, 10]. Funktionell rekonstituering och minigenomsystem har kartlagt cis-agerande promotorkrav i den genomiska 3′-änden och visat att N och P enkapsiderar mallar som känns igen av L/P-polymeraskomplexet för att generera både replikativa produkter och transkriptionsprodukter[11, 12]. Nukleär organisation och trafficking formar ytterligare replikationsprogrammet, där virala ”speckles of transcripts” (vSPOTs) och CRM1-beroende export av nukleoprotein bidrar till RNP-dynamik och kompartmentalisering av poly(A)+ kontra poly(A)− virala RNA:er[3, 13–15].
Keywords
- Bornavirus[1]
- Borna disease virus[4]
- icke-segmenterat negativsträngat RNA-virus[4]
- nukleär replikation[2]
- transkriptionell readthrough[5]
- vSPOTs[3]
- minigenom[11]
- CRM1-export[15]
- fosfoprotein P[15]
- RNA-beroende RNA-polymeras L[16]
Introduction
Bornavirus är NNS-RNA-virus vars promotor- och genstartskoncensussekvenser överensstämmer med mönster observerade inom familjer i ordningen Mononegavirales, vilket indikerar en delad logik för negativsträngad transkription på nivån för cis-agerande initieringselement[4, 17]. En central mekanistisk skillnad är att medan de flesta mononegavirus huvudsakligen replikerar i cytoplasman, replikerar bornavirus i kärnan, där de etablerar specialiserade nukleära säten för viral RNA-syntes[1, 3]. Experimentella bevis stöder specifikt att BDV-replikation och transkription äger rum i kärnorna i infekterade celler och är associerade med infektiösa ribonukleoproteinkomplex (BDV-RNP), vilket betonar att bornaviral RNA-syntes utförs i kontexten av nukleära RNP:er[4, 13]. Nukleär lokalisering stöds ytterligare av cellfraktionering som visar att det mesta nysyntetiserade BDV-RNA:t med genomisk polaritet är poly(A)− och till största del återfinns i den nukleära fraktionen, vilket är förenligt med nukleär replikation av det genomiska RNA:t[13].
Genome organization
Sekvensering och kartläggning av BDV-genomet identifierade ett linjärt genom på ~8,9 kb med de huvudsakliga öppna läsramarna förutspådda över genomet och flankerade av icke-kodande sekvenser vid båda termini[4, 5]. I en rapport förutspåddes fem stora ORF:er (I–V) i en BDV-genomsekvens på 8 903 nt, medan en annan beskrivning av BDV-genomet (8 910 nt) på liknande sätt noterade antisense-information för fem stora ORF:er flankerade av 53 nt icke-kodande sekvens vid 3′-terminus och 91 nt vid 5′-terminus[4, 5]. Utöver inramningen med fem ORF:er har kartläggning på antigenomninvå beskrivit tre transkriptionsenheter och sex ORF:er, och sammanfattningar på översiktsnivå beskriver likaledes BDV som kodande för sex ORF:er i tre transkriptionsenheter inramade av komplementära termini som påminner om andra NNS-RNA-virus[6, 7].
Den största kodande regionen (ORF V) kodar för ett förutspått protein på ~170 kDa med stark homologi till L-proteinfamiljen av polymeraser hos NNS-RNA-virus, vilket placerar det virala RNA-beroende RNA-polymeraset i den 5′-proximala änden av genuppsättningen i den kanoniska negativsträngade layouten[4]. Konserverad sekvensanalys identifierade högst homologi i en förmodad katalytisk domän med invarianta och konserverade rester klustrade i fyra högt konserverade motiv (A–D), vilket är förenligt med konserverade enzymatiska restriktioner för polymerasfunktion bland NNS-RNA-virus[18]. Infektiösa BDV-RNP:er har rapporterats innehålla endast en BDV-RNA-art, det negativa poly(A)− RNA:t på 9 kb, vilket stöder att poly(A)− RNA i genomlängd är den enkapsiderade mallarten i infektiösa RNP:er[13].
Bornavirusgenom bär också på regulatoriska gränsregioner som är typiska för NNS-RNA-virus, med ORF:er flankerade av icke-translaterade gränssekvenser som inkluderar transkriptionsinitierings- och stoppsignaler[8]. Terminala sekvenser kan baspara för att bilda en ”panhandle”-liknande struktur, och i BDV tillät inriktningen av de genomiska ändarna bildandet av en terminal panhandle med de första 3 nukleotiderna oparade, vilket länkar terminal komplementaritet till promotorarkitektur utan att kräva perfekt duplexbildning[5]. Det är viktigt att notera att analyser av BDV:s genomiska termini rapporterade både brist på perfekt terminal komplementaritet och ökad terminal sekvensheterogenitet under långvarig persistens, vilket indikerar att cis-agerande terminala regioner är variabla men funktionellt tolererade under olika infektionsstadier[11].
För att kortfattat sammanfatta genomets och genuttryckets arkitektur som de beskrivs i dessa källor, kontrasterar tabellen nedan flera ofta citerade organisatoriska särdrag.
Transcription and gene expression
Bornavirus genuttryck i BDV inkluderar flera polyadenylerade subgenomiska RNA:er komplementära till det negativsträngade genomet, där en studie identifierade nio arter av polyadenylerat subgenomiskt RNA, inklusive sex polycistroniska poly(A)+ RNA:er och monocistroniska mRNA:er motsvarande ORF I, II och IV[4]. I samma analys detekterades inte monocistroniska poly(A)+ RNA:er för ORF III och V, vilket indikerar att uttrycket av vissa kodande regioner i BDV inte domineras av enkla monocistroniska meddelanden[4]. Northern-analyser visade också att BDV transkriberar både mono- och polycistroniska RNA:er och använder terminerings-/polyadenyleringssignaler som påminner om andra negativsträngade RNA-virus, vilket är förenligt med ett stopp-start-transkriptionsprogram som ändå ger frekvent transkriptkontinuitet bortom termineringsställen[5].
Terminering och polyadenylering involverar diskreta ställen och en igenkännbar signal. Northern-hybridiseringsexperiment stödde användningen av specifika termineringsställen (T2, T3, T5 och T7) och identifierade en konsensussekvens för terminerings-/polyadenyleringssignaler, vilket ger molekylära landmärken för transkriptgränser och benägenhet för readthrough[5]. BDV är också anmärkningsvärt för en hög frekvens av readthrough-transkript jämfört med andra negativsträngade RNA-virus, vilket antyder att termineringseffektiviteten är systematiskt finjusterad och kan vara mekanistiskt nödvändig[5]. Faktum är att readthrough av T3 är nödvändig för uttrycket av p190 (polymerasprotein), vilket direkt länkar termineringssuppression till tillgängligheten av polymeras och därmed till kapaciteten för replikation och transkription[9].
BDV-mRNA:er är försedda med cap och är polyadenylerade, vilket visar att mRNA-mognad är förenlig med produktion av translationskompetenta RNA:er trots den nukleära replikationsnischen[19]. Ytterligare kodande mångfald genereras genom splitsning, eftersom 2,8 kb- och 7,1 kb-RNA:erna innehåller två introner som splitsas differentiellt för att ge RNA:er som kodar för flera produkter, inklusive G- och polymerasrelaterade proteiner, och separata uppgifter indikerar att L-uttryck kräver splitsning och suppression av terminering[6, 10]. På nivån för initiering och promotorstruktur verkar inte perfekt terminal komplementaritet krävas för hög promotoraktivitet, och ökad terminal komplementaritet främjade inte replikation kontra transkription av BDV-polymeraset, vilket indikerar att balansen mellan replikation och transkription inte bara är en funktion av styrkan i den terminala basparningen[11].
Replication cycle overview
Bornavirusreplikation definieras av nukleär RNA-syntes och nukleär organisering av virala RNP:er. Flera källor ger bevis för att BDV-replikation och transkription sker i kärnan i associering med infektiösa BDV-RNP:er, vilket fastställer att den funktionella mallen för RNA-syntes är ett RNP-komplex som opererar i den nukleära miljön[4, 13]. Kvantitativa fraktionerings- och märkningsexperiment visade vidare att det mesta nysyntetiserade BDV-RNA:et med genomisk polaritet är poly(A)− och nukleärt, vilket stöder slutsatsen att genomreplikation äger rum i kärnan hos infekterade celler[13].
Ett konsekvent kompartmentaliseringsmönster framträder för olika virala RNA-klasser. BDV 9 kb poly(A)− RNA är till största del nukleärt, medan nysyntetiserade poly(A)+ RNA:er transporteras till det cytoplasmatiska kompartmentet, vilket indikerar att mRNA-export och genomretention är separerade över kärnmembranet[13, 14]. Transport av BDV-mRNA har visats vara energiberoende, vilket antyder aktiv export snarare än passiv diffusion som en viktig kontrollpunkt för genuttryck vid nukleär bornavirusinfektion[20].
Bornavirus sammansätts även i nukleära virusfabriker beskrivna som ”viral Speckles Of Transcripts” (vSPOTs), vilket ger en strukturell kontext för koncentrerad transkription/replikation och potentiellt koordinerad RNA-processning i kärnan[1]. Hos BoDV-1 finns vSPOTs, bildade genom P-proteindriven vätska-vätska-fasseparation, i kärnan och interagerar nära med kromatin, inklusive dockning vid dubbelsträngsbrott i neuronalt DNA, vilket länkar replikationsställen till specifika nukleära substrukturer[3]. I enlighet med RNP-enheternas centrala roll har BDV-RNP-komplex som endast innehåller 9 kb-RNA-arten rapporterats besitta polymerasaktivitet som krävs för transkription och bära den genetiska information som behövs för att styra syntesen av BDV-makromolekyler och produktion av infektiösa BDV-partiklar, vilket kopplar RNP:er i genomlängd till nedströmssteg i den virala livscykeln[21].
RNP and polymerase machinery
BDV-genom RNA i fullängd är förpackat i RNP-komplex som innehåller N och det virala RNA-beroende RNA-polymeraskomplexet, vilket definierar kärnmaskineriet som en nukleokapsidmall bunden av polymeraskomplexet[15]. RdRp-komplexet består av P och L och ansvarar för replikation och transkription av det virala genomet, vilket etablerar L som den katalytiska underenheten och P som en essentiell polymeraskofaktor i BDV[15]. Strukturella och funktionella beskrivningar definierar vidare L som ett ~192 kDa RdRp som bildar kärnan i replikationskomplexet, utför transkription och replikation för att producera viralt mRNA och nya genomkopior, och associerar med P för effektiv RNA-syntes[16].
Proteininteraktionsegenskaper hos P ger mekanistisk insikt i polymerasfunktionen. P självassocierar i oligomerer genom en central oligomeriseringsdomän och överbryggar RdRp och nukleokapsiden, och den fungerar även som chaperon för N för att hålla det i en RNA-fri form som behövs för replikation, vilket stöder en modell där P koordinerar både enzymrekrytering och mallberedskap[3]. I enlighet med detta adresserade experimentell störning av P-oligomerisering i en minireplikonanalys huruvida oligomeriseringsdefekta P-mutanter kunde rekonstituera funktionella polymeraskomplex, och ingen av P-mutanterna stödde reporteruttryck, vilket indikerar att P-oligomerisering krävs för polymerasaktivitet under dessa förhållanden[22]. Dessutom regleras kofaktoraktiviteten hos P för BDV RdRp negativt genom fosforylering, vilket ger en tydlig posttranslationell regulatorisk hävstång för polymerasfunktionen[15].
Bornavirus nukleoproteinisoformer kopplar också proteinfunktion till intracellulär lokalisering. Experiment som uttrycker p40 och p38 visade att p40 främst är nukleärt medan p38 främst är cytoplasmatiskt, men båda binder BDV-fosfoprotein P, vilket tyder på att isoformberoende lokalisering kopplad till P-bindning kan modulera var RNP-sammansättning och/eller funktion sker[9]. I enlighet med en nukleär inriktningsroll för P innehåller P en stark bipartit nukleär lokaliseringssignal (NLS) vid sin amino-terminus och ytterligare svagare NLS-motiv, vilket stöder nukleär import av polymerasinnehållande komplex som en mekanistisk förutsättning för nukleär RNA-syntes[9].
Slutligen kan det accessoriska proteinet X direkt nedreglera RNA-syntes i rekonstituerade system. När BDV-polymeraskomplex rekonstituerades i celler som uttryckte X-protein, detekterades inget plussträngat minigenom-RNA, vilket tyder på att X hämmar både viral transkription och replikation i det analyssammanhanget[23]. Dessa observationer stöder tillsammans en maskinerimodell där L och P bildar den katalytiska kärnan, P-oligomerisering och fosforylering reglerar polymeraskompetens, och accessoriska faktorer som X kan undertrycka polymerasutdata under definierade förhållanden[15, 23].
Nuclear trafficking
Bornavirus kopplar nukleär replikation till reglerad nukleocytoplasmatisk trafficking av RNP-komponenter och RNA-arter. Direkta bevis indikerar att BDV-replikation och transkription äger rum i kärnor där infektiösa BDV-RNP:er är närvarande, och fraktionering indikerar att nysyntetiserat RNA med genomisk polaritet är starkt anrikat i den nukleära fraktionen, vilket ger en funktionell drivkraft för nukleära import- och exportvägar att koordinera livscykeln[13, 21]. RNA-transportanalyser indikerar att nysyntetiserade BDV-poly(A)+ RNA:er effektivt transporteras till det cytoplasmatiska kompartmentet medan det genomiska RNA:t på 9 kb förblir mestadels nukleärt, vilket visar på RNA-klasspecifikt exportbeteende[14]. Dessutom är mRNA-transport energiberoende, med försumbar export i frånvaro av ATP, vilket stöder aktiva, värdfaktorberoende exportmekanismer för virala mRNA:er[20].
För proteintrafficking är CRM1-beroende export involverad för nukleoprotein. Nukleär export av N sker via en CRM1-beroende väg förenlig med en NES, och en separat uppgift rapporterar på liknande sätt att nukleär export av BoDV-N sker via en CRM1-beroende väg, vilket indikerar konservering av denna exportväg inom bornavirus[15, 24]. Bredare översikter fastslår vidare att flera BDV-proteiner (inklusive nukleoprotein, fosfoprotein, X och L) bidrar till nukleocytoplasmatisk trafficking av BDV-RNP, och att riktningskontrollen sannolikt bestäms av förhållandena och interaktionerna mellan NLS- och NES-element i RNP:t, vilket ramar in trafficking som en emergent egenskap av konkurrerande lokaliseringssignaler snarare än en enda determinant[25].
Bildandet av nukleära virusfabriker ger ytterligare en organisatorisk nivå relevant för trafficking. Bornavirus sammansätter vSPOTs i kärnan, och BoDV-1 vSPOTs bildas genom P-proteindriven vätska-vätska-fasseparation och interagerar nära med kromatin, vilket kan begränsa diffusion och potentiellt styra positioneringen av transkriptions-/replikationsställen i förhållande till värdens nukleära landmärken[1, 3].
Reverse genetics and promoter elements
Bornavirus cis-agerande regulatoriska signaler är koncentrerade till icke-translaterade gräns- och terminalregioner. I BDV flankeras ORF:er av icke-translaterade gränssekvenser som innehåller regulatoriska signaler för transkriptionsinitiering och stopp, i enlighet med en Mononegavirales-liknande arkitektur av genstarts- och genstoppsignaler som vägleder polymerasets beteende längs genomet[8]. En härledd BDV-startkoncensussekvens (UNCNNNUUNN) är identisk med den som härletts genom att jämföra NNS-RNA-virus över flera Mononegavirales-familjer, vilket stöder konservering av det initieringsmotiv som används av polymerasmaskineriet[4, 17]. Terminerings-/polyadenyleringssignaler inkluderar en konserverad AUUUUU-sexmer vid 5′-änden av varje terminerings-/polyadenyleringssignal följt av GG (eller CG i ORF II), medan förmodade signaler inte kunde identifieras för ORF III i en analys, vilket indikerar både konservering och luckor i detekterbarheten av motiv över gengränser[4].
Metoder för revers genetik och minigenom har direkt testat dessa regulatoriska element. Ett RNA-polymeras I/polymeras II-system etablerades för intracellulär rekonstituering av BDV-RNA-replikation och transkription, vilket möjliggör kontrollerad dissektion av cis- och trans-agerande krav[11]. I detta system syntetiseras en BDV-RNA-analog (minigenom) av cellulärt RNA-polymeras I och innehåller BDV 5′- och 3′-otranslaterade cis-agerande sekvenser som krävs för BDV-polymerasmedierad RNA-syntes, vilket länkar terminala regioner till promotorfunktion i celler[11]. Enkapsidering av polymeras I-härlett minigenom-RNA med plasmidtillfört BDV N och P genererar en mall som känns igen av det rekonstituerade BDV-polymeraset för att styra syntesen av fullängds antiminigenom-RNA (replikation) och ett subgenomiskt mRNA som kodar för en reportergen, vilket experimentellt visar att N- och P-enkapsidering är tillräcklig för att göra RNA:t kompetent för polymerasigenkänning och RNA-syntes med dubbla utdata[11].
Promotorkartläggning förfinar ytterligare den cis-agerande modellen. Nedströmssekvenser (nukleotider 25 till 33) krävdes för optimal promotoraktivitet, och deletion av nukleotider 34 till 35 upphävde reporteraktiviteten i detta sammanhang, vilket identifierade korta, positionsspecifika promotor-proximala krav i den genomiska 3′-promotorregionen[12]. Tillsammans stöder dessa data en promotorarkitektur där kompakta terminala sekvenser och närliggande nedströmselement styr initiering och produktiv replikation/transkription i det rekonstituerade polymerassystemet[11, 12].
Persistence mechanisms
Bornavirus molekylära persistens är länkad till genomändsdynamik, nukleär replikation och specialiserad nukleär organisation. En ”realign-and-elongation”-process förnyar 3′-termini hos v- och cRNA-molekyler från interna mallar under varje replikationsomgång och kan endast ske om termini är kompletta, vilket utgör ett explicit mekanistiskt steg som fungerar som en kvalitetskontroll för genomets integritet[26]. Denna process ger integrerad kvalitetskontroll som undertrycker replikation av RNA-molekyler med terminala deletioner, vilket kopplar ändreparationslogik till selektion mot defekta replikationsintermediärer[26]. Parallellt rapporterade analyser av genomiska termini under långvarig persistent infektion en högre grad av terminal heterogenitet i RNA från persistent infekterade celler jämfört med akuta tidpunkter, vilket indikerar att persistens åtföljs av skiften i fördelningen av genomändsvarianter[11].
Persistens är också associerad med en stabil nukleär kontext för RNP:er. Bornavirus har beskrivits som unika bland kända NNS-RNA-virus hos djur genom att de replikerar och transkriberar i kärnan, vilket ger den cellulära kompartmentaliserade miljön för långvarig icke-cytolytisk RNA-syntes och nukleär genomändsprocessning[2]. Dessutom konstruerar BoDV-1 sina vRNP:er med hjälp av värdkromatin som ett fundament, en egenskap som mekanistiskt kan stödja persistens i kärnan genom att stabilisera vRNP-positionering i förhållande till kromatin[27].
Modulering av värdrespons har också experimentellt länkats till infektionsstadier. BDV-infekterade celler utsöndrade mindre SEAP än kontrollceller efter Pam3CSK4-aktivering, vilket tyder på att BDV-infekterade celler aktivt undertrycker NF-κB-signalering, vilket ger en korrelat på molekylär nivå för förändrad medfödd signalering under persistent infektion[28].
Open questions
Flera molekylära frågor förblir öppna eller är redo för riktade experiment baserat på de mekanistiska fynd som sammanfattas ovan.
- Vilka sekvens- och strukturdeterminanter kontrollerar BDV-termineringseffektiviteten och den höga frekvensen av readthrough-transkript, särskilt vid T3 där readthrough är essentiell för polymerasuttryck[5, 9]?
- Hur interagerar alternativa splitsningshändelser i 2,8 kb- och 7,1 kb-RNA:erna med användningen av transkriptionsgränser för att ge korrekt stökiometri av G- och polymerasrelaterade produkter, inklusive fall där L-uttryck kräver splitsning och suppression av terminering[6, 10]?
- Vad är det kvantitativa förhållandet mellan den terminala heterogenitet som observeras under persistens och promotoraktivitet, givet att perfekt terminal komplementaritet inte krävs för hög promotoraktivitet och att termini diversifieras under långvarig infektion[11]?
- Hur koordineras kvalitetskontrollsteget ”realign-and-elongation” med nukleär RNP-organisation, givet att förnyelse av 3′-termini härrör från interna mallar och undertrycker replikation av terminalt deleterade RNA:er[26]?
- Vilka värdfaktorer och nukleära landmärken styr bildandet och positioneringen av P-drivna fasseparerade vSPOTs som interagerar med kromatin och dockar vid dubbelsträngsbrott i neuronalt DNA[3]?
- Hur integreras CRM1-beroende export av nukleoprotein och energiberoende mRNA-export för att reglera kompartmentaliseringen av poly(A)+ RNA:er kontra poly(A)− genomiskt RNA över kärnmembranet[13, 15, 20]?
- Genom vilken molekylär mekanism undertrycker X-protein ackumulering av minigenom-RNA, och hur interagerar denna suppression med P-fosforyleringsberoende negativ reglering av polymeraskofaktoraktivitet[15, 23]?
