要旨
Bornaviruses（例：Borna disease virus、BDV；Borna disease virus 1、BoDV-1）は、非分節型のマイナス鎖一本鎖RNAウイルスであり、動物の非分節型マイナス鎖RNA（NNS-RNA）ウイルスの中で最も際立った特徴は、ゲノムの転写および複製が主に細胞質ではなく宿主細胞の核内で行われる点である[1–3]。BDVの分子学的研究により、コンパクトな約8.9–9 kbのゲノムが定義されており、少数の転写ユニットに整理された複数のオープンリーディングフレーム（ORF）を有し、ウイルスRNA合成のプロモーターおよび制御境界として機能するシストロン外末端配列によって挟まれている[4–8]。遺伝子発現は複雑であり、モノシストロニックおよびポリシストロニックなpoly(A)+ RNAの両方の産生、終結部位における頻繁なリードスルー、および一部の転写コンテキストにおけるポリメラーゼ（L）を含む主要産物の発現のためのスプライシングの利用が含まれる[4–6, 9, 10]。機能的再構成およびミニゲノムシステムにより、3′ ゲノム末端におけるシス作用性プロモーター要件がマッピングされ、NおよびPがL/Pポリメラーゼ複合体によって認識されるテンプレートをヌクレオキャプシド化し、複製産物と転写産物の両方を生成することが示されている[11, 12]。核内の組織化と輸送は複製プログラムをさらに形作っており、ウイルスの「転写産物スペックル（vSPOTs）」やCRM1依存的なヌクレオタンパク質の核外搬出が、RNPのダイナミクス、およびpoly(A)+ とpoly(A)− ウイルスRNAのコンパートメント化に寄与している[3, 13–15]。
キーワード
- Bornavirus[1]
- Borna disease virus[4]
- nonsegmented negative-strand RNA virus[4]
- nuclear replication[2]
- transcription readthrough[5]
- vSPOTs[3]
- minigenome[11]
- CRM1 export[15]
- phosphoprotein P[15]
- RNA-dependent RNA polymerase L[16]
はじめに
BornavirusesはNNS-RNAウイルスであり、そのプロモーターおよび遺伝子開始コンセンサス配列はMononegavirales目の各科で観察されるパターンと一致しており、シス作用性開始エレメントのレベルで共通のマイナス鎖転写ロジックを有することを示唆している[4, 17]。中心的なメカニズムの相違点は、ほとんどのモノネガウイルスが主に細胞質で複製するのに対し、Bornavirusesは核内で複製し、ウイルスRNA合成のための特殊な核内部位を構築することである[1, 3]。実験的証拠は、BDVの複製と転写が感染細胞の核内で行われ、感染性のリボヌクレオタンパク質複合体（BDV-RNPs）と関連していることを具体的に支持しており、BornavirusesのRNA合成が核内RNPの文脈で実行されることを強調している[4, 13]。核局在化は細胞分画によっても裏付けられており、新たに合成されたゲノム極性のBDV RNAの大部分はpoly(A)− であり、主に核分画で見出されることから、ゲノムRNAの核内複製と一致している[13]。
ゲノム構成
BDVのゲノム配列決定とマッピングにより、ゲノム全体にわたって予測される主要なオープンリーディングフレームを有し、両末端が非コード配列によって挟まれた線状の約8.9 kbゲノムが同定された[4, 5]。ある報告では、8,903 ntのBDVゲノム配列において5つの主要なORF（I–V）が予測され、別のBDVゲノム（8,910 nt）の記述でも同様に、3′ 末端の53 ntと5′ 末端の91 ntの非コード配列に挟まれた5つの主要なORFのアンチセンス情報が指摘されている[4, 5]。5つのORF枠に加えて、アンチゲノムレベルのマッピングでは3つの転写ユニットと6つのORFが記述されており、レビューレベルの要約でも同様に、他のNNS RNAウイルスを彷彿とさせる相補的な末端に挟まれた3つの転写ユニットに6つのORFをコードするものとしてBDVを記述している[6, 7]。
最大のコード領域（ORF V）は、NNS-RNAウイルスポリメラーゼのLタンパク質ファミリーと強い相同性を持つ約170 kDaの予測タンパク質をコードしており、標準的なマイナス鎖のレイアウトにおいてウイルスRNA依存性RNAポリメラーゼを遺伝子セットの5′ 近位末端に配置している[4]。保存配列解析により、推定触媒ドメインにおいて最も高い相同性が同定され、不変かつ保存的に維持された残基が4つの高度に保存されたモチーフ（A–D）にクラスター化しており、これはNNS-RNAウイルス間でのポリメラーゼ機能に対する保存された酵素的制約と一致している[18]。感染性BDV-RNPsには、1種類のBDV RNA種、すなわちpoly(A)− のマイナス極性9 kb RNAのみが含まれることが報告されており、ゲノム長のpoly(A)− RNAが感染性RNPにおけるヌクレオキャプシド化されたテンプレート種であることが裏付けられている[13]。
Bornavirusesのゲノムは、NNS-RNAウイルスに典型的な調節境界領域も有しており、ORFは転写開始および停止シグナルを含む非翻訳境界配列によって挟まれている[8]。末端配列は塩基対を形成してパンハンドルのような構造をとることができ、BDVではゲノム末端のアライメントにより、最初の3ヌクレオチドが不対の状態で末端パンハンドルが形成され、完全な二本鎖形成を必要とせずに末端相補性をプロモーター構造に結びつけている[5]。重要なことに、BDVゲノム末端の解析では、長期の持続感染中に完全な末端相補性の欠如と末端配列の不均一性の増加の両方が報告されており、シス作用性末端領域は可変的でありながら、感染状態全体で機能的に許容されることを示している[11]。
これらの情報源に記述されているゲノムおよび遺伝子発現の構造を簡潔にまとめるため、以下の表に、頻繁に引用されるいくつかの構成的特徴を対比させる。
転写および遺伝子発現
BDVにおけるBornavirusesの遺伝子発現には、マイナス鎖ゲノムに相補的な複数のポリアデニル化サブゲノムRNAが含まれており、ある研究では、6つのポリシストロニックpoly(A)+ RNAと、ORF I、II、およびIVに対応するモノシストロニックmRNAを含む、9種類のポリアデニル化サブゲノムRNAが同定されている[4]。同じ解析において、ORF IIIおよびVのモノシストロニックpoly(A)+ RNAは検出されず、BDVにおける一部のコード領域の発現は単純なモノシストロニックなメッセージによって支配されていないことが示された[4]。ノーザン解析によっても、BDVがモノシストロニックおよびポリシストロニックRNAの両方を転写し、他のマイナス鎖RNAウイルスを彷彿とさせる停止/ポリアデニル化シグナルを使用していることが示され、これは終結部位を超えて頻繁に転写が継続（リードスルー）されるものの、ストップ-スタート転写プログラムと一致している[5]。
終結とポリアデニル化には、個別の部位と認識可能なシグナルが関与している。ノーザンハイブリダイゼーション実験は、特定の終結部位（T2、T3、T5、およびT7）の使用を支持し、終結/ポリアデニル化シグナルのコンセンサス配列を同定したことで、転写境界およびリードスルーの傾向に関する分子学的指標を提供した[5]。BDVはまた、他のマイナス鎖RNAウイルスと比較してリードスルー転写の頻度が高いことが顕著であり、終結効率が体系的に調整されており、メカニズム的に不可欠である可能性を示唆している[5]。実際に、T3のリードスルーはp190（ポリメラーゼタンパク質）の発現に不可欠であり、終結抑制をポリメラーゼの利用可能性、ひいては複製および転写能力に直接結びつけている[9]。
BDVのmRNAはキャップされ、ポリアデニル化されており、mRNAの成熟が核内複製というニッチにもかかわらず翻訳能を有するRNAの産生と一致していることを示している[19]。2.8 kbおよび7.1 kbのRNAには2つのイントロンが含まれており、これらが特異的にスプライシングされてGおよびポリメラーゼ関連タンパク質を含む複数の産物をコードするRNAを生成することから、スプライシングによってさらなるコーディングの多様性が生み出される。また、Lの発現にはスプライシングと終結の抑制が必要であるとの個別の指摘もある[6, 10]。開始およびプロモーター構造のレベルでは、高いプロモーター活性のために完全な末端相補性は必要ないようであり、末端相補性の増加はBDVポリメラーゼによる複製対転写を促進しなかったことから、複製と転写のバランスは単に末端塩基対の強度の関数ではないことが示されている[11]。
複製サイクルの概要
Bornavirusesの複製は、核内RNA合成およびウイルスRNPの核内組織化によって定義される。複数の情報源が、BDVの複製と転写が感染性BDV-RNPsに関連して核内で行われるという証拠を提供しており、RNA合成の機能的テンプレートが核環境で作動するRNP複合体であることを確立している[4, 13]。定量的な分画および標識実験により、新たに合成されたBDVゲノム極性RNAの大部分がpoly(A)− で核内に存在することがさらに示され、ゲノム複製が感染細胞の核内で行われるという結論を支持している[13]。
異なる種類のウイルスRNAについて、一貫したコンパートメント化のパターンが見られる。BDVの9 kb poly(A)− RNAは主に核内に存在するが、新たに合成されたpoly(A)+ RNAは細胞質コンパートメントへ輸送され、mRNAの核外搬出とゲノムの核内保持が核膜を介して分離されていることを示している[13, 14]。BDV mRNAの輸送はエネルギー依存的であることが示されており、核内Bornaviruses感染における遺伝子発現の主要な制御点として、受動拡散ではなく能動的な核外搬出が行われていることが示唆されている[20]。
Bornavirusesはまた、「転写産物スペックル（vSPOTs）」と呼ばれる核内ウイルス工場を形成し、核内での集中的な転写/複製、および潜在的に調整されたRNAプロセシングのための構造的文脈を提供している[1]。BoDV-1では、Pタンパク質駆動の液-液相分離によって形成されたvSPOTsが核内に存在し、ニューロンのDNA二本鎖切断部位へのドッキングを含む、クロマチンとの密接な相互作用を通じて複製部位を特定の核下部構造に結びつけている[3]。RNPの中心性と一致して、9 kb RNA種のみを含むBDV-RNP複合体は、転写に必要なポリメラーゼ活性を有し、BDV高分子の合成および感染性BDV粒子の産生を指示するために必要な遺伝情報を保持していることが報告されており、ゲノム長のRNPをウイルスライフサイクルの下流ステップに結びつけている[21]。
RNPおよびポリメラーゼ機構
BDVのゲノム長RNAは、NおよびウイルスRNA依存性RNAポリメラーゼ複合体を含むRNP複合体へとパッケージングされており、そのコア機構はポリメラーゼ複合体が結合したヌクレオキャプシドテンプレートとして定義される[15]。RdRp複合体はPおよびLで構成され、ウイルスゲノムの複製および転写を担っており、BDVにおいてLを触媒サブユニット、Pを必須のポリメラーゼ補因子として確立している[15]。構造的および機能的記述により、Lは約192 kDaのRdRpであり、複製複合体のコアを形成して転写および複製を行い、ウイルスmRNAおよび新しいゲノムコピーを産生し、効率的なRNA合成のためにPと会合することがさらに定義されている[16]。
Pのタンパク質相互作用特性は、ポリメラーゼ機能に関するメカニズム的洞察を提供している。Pは中央のオリゴマー化ドメインを介してオリゴマーとして自己会合し、RdRpとヌクレオキャプシドの間を橋渡しするとともに、複製に必要なRNAを含まない形態でNを維持するためのシャペロンとしても機能しており、Pが酵素の動員とテンプレートの準備の両方を調整するというモデルを支持している[3]。これと一致して、ミニレプリコンアッセイにおけるPのオリゴマー化の実験的阻害により、オリゴマー化欠損P変異体が機能的なポリメラーゼ複合体を再構成できるかどうかが検証されたが、いずれのP変異体もレポーター発現を支持せず、これらの条件下でのポリメラーゼ活性にはPのオリゴマー化が必要であることが示された[22]。加えて、BDV RdRpに対するPの補因子活性はリン酸化によって負に調節されており、ポリメラーゼ機能に対する明確な翻訳後調節機構を提供している[15]。
Bornavirusesのヌクレオタンパク質アイソフォームも、タンパク質機能と細胞内局在を結びつけている。p40およびp38を発現させる実験では、p40は主に核内に局在するのに対し、p38は主に細胞質に局在することが示されたが、両者はBDVリンタンパク質Pと結合することから、P結合と組み合わせたアイソフォーム依存的な局在化が、RNPの構築および/または機能が生じる場所を調節している可能性が示唆されている[9]。Pの核標的化の役割と一致して、Pはそのアミノ末端に強力な二部型核局在化シグナル（NLS）を有し、さらに弱いNLSモチーフを複数有しており、核内でのRNA合成のメカニズム的前提条件として、ポリメラーゼ含有複合体の核内移行を支持している[9]。
最後に、アクセサリータンパク質Xは、再構成系においてRNA合成を直接ダウンモジュレートすることができる。Xタンパク質を発現している細胞内でBDVポリメラーゼ複合体を再構成した際、プラス鎖ミニゲノムRNAは検出されなかったことから、そのアッセイコンテキストにおいてXがウイルスの転写と複製の両方を阻害することが示唆されている[23]。これらの観察結果を総合すると、LとPが触媒コアを形成し、Pのオリゴマー化とリン酸化がポリメラーゼの能力を調節し、Xなどのアクセサリー因子が特定の条件下でポリメラーゼ出力を抑制するという機構モデルが支持される[15, 23]。
核内輸送
Bornavirusesは、核内複製と、RNP成分およびRNA種の制御された核細胞質間輸送を組み合わせている。直接的な証拠は、BDVの複製と転写が感染性BDV RNPが存在する核内で行われることを示しており、分画により新たに合成されたゲノム極性RNAが核分画に強く濃縮されていることが示されている。これは、ライフサイクルを調整するために核内移行および核外搬出経路が必要であるという機能的動機を与えている[13, 21]。RNA輸送アッセイは、新たに合成されたBDV poly(A)+ RNAが細胞質コンパートメントへ効率的に輸送される一方で、9 kb ゲノムRNAはほとんど核内に留まることを示しており、RNAクラス特異的な核外搬出挙動を実証している[14]。さらに、mRNAの輸送はエネルギー依存的であり、ATP欠乏下では核外搬出が無視できるほどであることから、ウイルスmRNAの能動的かつ宿主因子依存的な核外搬出メカニズムが支持される[20]。
タンパク質の輸送については、ヌクレオタンパク質にCRM1依存的な核外搬出が関与している。Nの核外搬出は、NESと一致するCRM1依存性経路を介しており、別の記述でもBoDV-Nの核外搬出がCRM1依存性経路を介して行われることが報告されている。これはBornaviruses内におけるこの核外搬出経路の保存性を示唆している[15, 24]。より広範なレビューでは、数種類のBDVタンパク質（ヌクレオタンパク質、リンタンパク質、X、およびLを含む）がBDV RNPの核細胞質間輸送に寄与しており、方向性の制御はRNP内のNLSとNESエレメントの比率および相互作用によって決定される可能性が高いと述べられており、輸送は単一の決定因子ではなく、競合する局在化シグナルの創発的特性として組み立てられている[25]。
核内ウイルス工場の形成は、輸送に関連するさらなる組織化レベルを提供している。Bornavirusesは核内にvSPOTsを構築し、BoDV-1のvSPOTsはPタンパク質駆動の液-液相分離によって形成され、クロマチンと密接に相互作用する。これにより拡散が制約され、宿主の核内指標に対する転写/複製部位の位置決めが方向付けられる可能性がある[1, 3]。
リバースジェネティクスおよびプロモーターエレメント
Bornavirusesのシス作用性調節シグナルは、非翻訳の境界領域および末端領域に集中している。BDVにおいて、ORFは転写開始および停止のための調節シグナルを含む非翻訳境界配列に挟まれており、これはゲノムに沿ったポリメラーゼの挙動を誘導する遺伝子開始および遺伝子停止シグナルというMononegavirales目様の構造と一致している[8]。推定されたBDV開始コンセンサス配列（UNCNNNUUNN）は、複数のMononegavirales科にわたるNNS-RNAウイルスの比較により推論された配列と同一であり、ポリメラーゼ機構によって使用される開始モチーフの保存性を裏付けている[4, 17]。終結/ポリアデニル化シグナルには、各終結/ポリアデニル化シグナルの5′ 末端に保存されたAUUUUUの6量体とそれに続くGG（またはORF IIではCG）が含まれるが、ある解析ではORF IIIの推定シグナルは特定できず、遺伝子境界を越えたモチーフの検出可能性に保存性とギャップの両方があることを示している[4]。
リバースジェネティクスおよびミニゲノムアプローチにより、これらの調節エレメントが直接テストされている。BDVのRNA複製および転写を細胞内で再構成するために、RNA polymerase I/polymerase IIシステムが確立され、シスおよびトランス作用性要件の制御された解剖が可能になった[11]。このシステムにおいて、BDV RNAアナログ（ミニゲノム）は細胞のRNA polymerase Iによって合成され、BDVポリメラーゼによるRNA合成に必要なBDV 5′ および3′ 非翻訳シス作用性配列を含んでおり、末端領域を細胞内でのプロモーター機能に結びつけている[11]。プラスミドから供給されたBDV NおよびPによるpolymerase I由来ミニゲノムRNAのヌクレオキャプシド化により、再構成されたBDVポリメラーゼによって認識されるテンプレートが生成され、全長アンチミニゲノムRNAの合成（複製）およびレポーター遺伝子をコードするサブゲノムmRNAの合成が指示される。これにより、NおよびPによるヌクレオキャプシド化が、RNAをポリメラーゼによる認識および二重出力のRNA合成に適合させるのに十分であることが実験的に実証された[11]。
プロモーターマッピングにより、シス作用性モデルがさらに精緻化されている。下流配列（ヌクレオチド25から33）は最適なプロモーター活性に必要であり、ヌクレオチド34から35の欠失はこのコンテキストにおいてレポーター活性を無効にすることから、3′ ゲノムプロモーター領域における短く、位置特異的なプロモーター近位の要件が特定された[12]。これらのデータを総合すると、コンパクトな末端配列と近接する下流エレメントが、再構成されたポリメラーゼシステムにおける開始および生産的な複製/転写を支配するプロモーター構造を支持している[11, 12]。
持続感染機構
Bornavirusesの分子学的持続感染は、ゲノム末端のダイナミクス、核内複製、および特殊な核内組織化に関連している。「リアライン・アンド・エロンゲーション（realign-and-elongation）」プロセスは、複製の各ラウンドにおいて内部テンプレートからvRNAおよびcRNA分子の3′ 末端を更新し、これは末端が完全である場合にのみ発生し得るため、ゲノムの完全性に関する明示的なメカニズム的ステップ（品質管理チェックポイント）として機能する[26]。このプロセスは、末端欠失を伴うRNA分子の複製を抑制する統合的な品質管理を提供し、末端修復のロジックを欠陥のある複製中間体に対する選択に結びつけている[26]。並行して、長期の持続感染中におけるゲノム末端の解析では、急性期の時点と比較して持続感染細胞由来のRNAにおいて末端の不均一性が高いことが報告されており、持続感染がゲノム末端バリアントの分布の変化を伴うことを示している[11]。
持続感染は、RNPのための安定した核内コンテキストとも関連している。Bornavirusesは、既知の動物NNS RNAウイルスの中で唯一、核内で複製および転写を行うと記述されており、これにより長期的な非細胞傷害性RNA合成および核内ゲノム末端プロセシングのための細胞内コンパートメント設定が提供される[2]。さらに、BoDV-1は宿主のクロマチンを足場としてvRNPを構築するが、この特性はクロマチンに対するvRNPの配置を安定化させることで、核内での持続感染をメカニズム的にサポートすることができる[27]。
宿主応答の調節も、感染状態と実験的に結びつけられている。BDV感染細胞は、Pam3CSK4による活性化後にmock細胞よりもSEAPの分泌が少なく、これはBDV感染細胞がNF-κBシグナル伝達を能動的に抑制していることを示唆しており、持続感染中の先天性シグナル伝達の変化に関する分子レベルの相関関係を提供している[28]。
今後の課題
上記のメカニズム的知見に基づき、いくつかの分子学的疑問が未解決のまま残されているか、あるいは標的を絞った実験の対象として位置づけられている。
- BDVの終結効率およびリードスルー転写の頻度の高さを制御している配列および構造的決定因子は何か。特に、ポリメラーゼ発現にリードスルーが不可欠であるT3においてそれらはどう機能しているか[5, 9]。
- 2.8 kbおよび7.1 kbのRNAにおける選択的スプライシングイベントは、どのように転写境界の使用と連動して、Lの発現にスプライシングと終結の抑制が必要なケースを含め、Gおよびポリメラーゼ関連産物の正しい化学量論的比率を生み出しているのか[6, 10]。
- 高いプロモーター活性のために完全な末端相補性は必要なく、長期感染中に末端が多様化することを踏まえ、持続感染中に観察される末端の不均一性とプロモーター活性の間の定量的な関係はどのようなものか[11]。
- 3′ 末端の更新が内部テンプレートに由来し、末端欠失RNAの複製を抑制することを考慮すると、リアライン・アンド・エロンゲーションの品質管理ステップは核内RNP組織化とどのように調整されているのか[26]。
- クロマチンと相互作用し、ニューロンのDNA二本鎖切断部位にドッキングするP駆動型の相分離vSPOTsの形成と配置を支配する宿主因子および核内指標はどれか[3]。
- CRM1依存的なヌクレオタンパク質の核外搬出とエネルギー依存的なmRNAの核外搬出は、核膜を介したpoly(A)+ RNAとpoly(A)− ゲノムRNAのコンパートメント化を制御するためにどのように統合されているのか[13, 15, 20]。
- どのような分子メカニズムによってXタンパク質はミニゲノムRNAの蓄積を抑制するのか。また、この抑制はPのリン酸化依存的なポリメラーゼ補因子活性の負の調節とどのように交差しているのか[15, 23]。
