Περίληψη
Οι Bornaviruses (π.χ., ο ιός της νόσου Borna, BDV· ο ιός της νόσου Borna 1, BoDV-1) είναι μη κατακερματισμένοι, αρνητικής πολικότητας μονόκλωνοι RNA ιοί, των οποίων το πιο ιδιαίτερο χαρακτηριστικό μεταξύ των ζωικών μη κατακερματισμένων αρνητικού κλώνου RNA (NNS-RNA) ιών είναι ότι η μεταγραφή και ο αναδιπλασιασμός του γονιδιώματος λαμβάνουν χώρα στον πυρήνα του κυττάρου-ξενιστή και όχι κυρίως στο κυτταρόπλασμα[1–3]. Μοριακές μελέτες του BDV έχουν καθορίσει ένα συμπαγές γονιδίωμα μεγέθους ~8.9–9 kb με πολλαπλά ανοικτά πλαίσια ανάγνωσης οργανωμένα σε μικρό αριθμό μεταγραφικών μονάδων, τα οποία πλαισιώνονται από εξωκιστρονικές τερματικές αλληλουχίες που λειτουργούν ως προαγωγείς και ρυθμιστικά όρια για τη σύνθεση του ιικού RNA[4–8]. Η γονιδιακή έκφραση είναι περίπλοκη και περιλαμβάνει την παραγωγή τόσο μονο- όσο και πολυκιστρονικών poly(A)+ RNA, συχνή ανάγνωση πέραν των θέσεων τερματισμού (readthrough), και τη χρήση ματίσματος (splicing) για την έκφραση βασικών προϊόντων, συμπεριλαμβανομένης της πολυμεράσης (L) σε ορισμένα μεταγραφικά πλαίσια[4–6, 9, 10]. Συστήματα λειτουργικής ανασύστασης και μινι-γονιδιώματος (minigenome) έχουν χαρτογραφήσει τις cis-δρώσες απαιτήσεις του προαγωγέα στο 3′ γονιδιωματικό άκρο και έχουν δείξει ότι οι N και P εγκλειδώνουν σε καψίδιο πρότυπα που αναγνωρίζονται από το σύμπλοκο πολυμεράσης L/P για τη δημιουργία τόσο αναδιπλασιαστικών όσο και μεταγραφικών προϊόντων[11, 12]. Η πυρηνική οργάνωση και η διακίνηση διαμορφώνουν περαιτέρω το πρόγραμμα αναδιπλασιασμού, με τα ιικά «στίγματα μεταγραφημάτων» (vSPOTs) και την εξαρτώμενη από την CRM1 εξαγωγή της πυρηνοπρωτεΐνης να συμβάλλουν στη δυναμική των RNP και τη διαμερισματοποίηση των poly(A)+ έναντι των poly(A)− ιικών RNA[3, 13–15].
Λέξεις-κλειδιά
- Bornavirus[1]
- Borna disease virus[4]
- nonsegmented negative-strand RNA virus[4]
- nuclear replication[2]
- transcription readthrough[5]
- vSPOTs[3]
- minigenome[11]
- CRM1 export[15]
- phosphoprotein P[15]
- RNA-dependent RNA polymerase L[16]
Εισαγωγή
Οι Bornaviruses είναι NNS-RNA ιοί των οποίων ο προαγωγέας και οι συναινετικές αλληλουχίες έναρξης γονιδίων ευθυγραμμίζονται με πρότυπα που παρατηρούνται σε όλες τις οικογένειες των Mononegavirales, υποδηλώνοντας μια κοινή λογική μεταγραφής αρνητικού κλώνου στο επίπεδο των cis-δρώντων στοιχείων έναρξης[4, 17]. Μια κεντρική μηχανιστική διάκριση είναι ότι, ενώ οι περισσότεροι μονοαρνητικοιοί αναδιπλασιάζονται κυρίως στο κυτταρόπλασμα, οι Bornaviruses αναδιπλασιάζονται στον πυρήνα, όπου δημιουργούν εξειδικευμένες πυρηνικές θέσεις για τη σύνθεση του ιικού RNA[1, 3]. Πειραματικά δεδομένα υποστηρίζουν ειδικά ότι ο αναδιπλασιασμός και η μεταγραφή του BDV λαμβάνουν χώρα στους πυρήνες των μολυσμένων κυττάρων και σχετίζονται με λοιμογόνα σύμπλοκα ριβονουκλεοπρωτεϊνών (BDV-RNPs), τονίζοντας ότι η σύνθεση του RNA των Bornaviruses εκτελείται στο πλαίσιο των πυρηνικών RNP[4, 13]. Ο πυρηνικός εντοπισμός υποστηρίζεται περαιτέρω από την κλασμάτωση κυττάρων που δείχνει ότι το μεγαλύτερο μέρος του νεοσυντιθέμενου BDV RNA γονιδιωματικής πολικότητας είναι poly(A)− και βρίσκεται κυρίως στο πυρηνικό κλάσμα, γεγονός που συνάδει με τον πυρηνικό αναδιπλασιασμό του γονιδιωματικού RNA[13].
Οργάνωση γονιδιώματος
Η αλληλούχιση και η χαρτογράφηση του γονιδιώματος του BDV ταυτοποίησαν ένα γραμμικό γονιδίωμα μεγέθους ~8.9 kb με κύρια ανοικτά πλαίσια ανάγνωσης που προβλέπονται σε όλο το γονιδίωμα και πλαισιώνονται από μη κωδικοποιούσες αλληλουχίες και στα δύο άκρα[4, 5]. Σε μια αναφορά, προβλέφθηκαν πέντε κύρια ORF (I–V) σε μια αλληλουχία γονιδιώματος BDV 8,903-nt, ενώ μια άλλη περιγραφή του γονιδιώματος BDV (8,910 nt) σημείωσε ομοίως αντιπληροφορίες για πέντε κύρια ORF που πλαισιώνονται από 53 nt μη κωδικοποιούσας αλληλουχίας στο 3′ άκρο και 91 nt στο 5′ άκρο[4, 5]. Εκτός από το πλαίσιο των πέντε ORF, η χαρτογράφηση σε επίπεδο αντιγονιδιώματος έχει περιγράψει τρεις μεταγραφικές μονάδες και έξι ORF, και ανασκοπικές περιλήψεις περιγράφουν ομοίως τον BDV ως κωδικοποιούντα έξι ORF σε τρεις μεταγραφικές μονάδες που πλαισιώνονται από συμπληρωματικά άκρα που θυμίζουν άλλους NNS RNA ιούς[6, 7].
Η μεγαλύτερη κωδικοποιούσα περιοχή (ORF V) κωδικοποιεί μια προβλεπόμενη πρωτεΐνη ~170 kDa με ισχυρή ομολογία με την οικογένεια πρωτεϊνών L των πολυμερασών των NNS-RNA ιών, τοποθετώντας την ιική RNA-εξαρτώμενη RNA πολυμεράση στο 5′-εγγύς άκρο του συνόλου των γονιδίων στην κανονική διάταξη του αρνητικού κλώνου[4]. Η ανάλυση συντηρημένων αλληλουχιών ταυτοποίησε την υψηλότερη ομολογία σε μια πιθανή καταλυτική περιοχή με αμετάβλητα και συντηρημένα κατάλοιπα ομαδοποιημένα σε τέσσερα εξαιρετικά συντηρημένα μοτίβα (A–D), γεγονός που συνάδει με τους συντηρημένους ενζυμικούς περιορισμούς στη λειτουργία της πολυμεράσης μεταξύ των NNS-RNA ιών[18]. Έχει αναφερθεί ότι τα λοιμογόνα BDV-RNPs περιέχουν μόνο ένα είδος BDV RNA, το poly(A)−, αρνητικής πολικότητας RNA των 9-kb, υποστηρίζοντας ότι το poly(A)− RNA γονιδιωματικού μήκους είναι το είδος του προτύπου που εγκλειδώνεται στο καψίδιο στα λοιμογόνα RNP[13].
Τα γονιδιώματα των Bornaviruses φέρουν επίσης ρυθμιστικές οριακές περιοχές τυπικές των NNS-RNA ιών, με τα ORF να πλαισιώνονται από μη μεταφραζόμενες οριακές αλληλουχίες που περιλαμβάνουν σήματα έναρξης και διακοπής της μεταγραφής[8]. Οι τερματικές αλληλουχίες μπορούν να σχηματίσουν ζεύγη βάσεων για τη δημιουργία μιας δομής δίκην λαβής τηγανιού (panhandle-like), και στον BDV η ευθυγράμμιση των γονιδιωματικών άκρων επέτρεψε το σχηματισμό μιας τερματικής λαβής με τα πρώτα 3 νουκλεοτίδια μη συζευγμένα, συνδέοντας τη συμπληρωματικότητα των άκρων με την αρχιτεκτονική του προαγωγέα χωρίς να απαιτείται τέλεια διπλή έλικα[5]. Είναι σημαντικό ότι αναλύσεις των γονιδιωματικών άκρων του BDV ανέφεραν τόσο έλλειψη τέλειας τερματικής συμπληρωματικότητας όσο και αυξημένη ετερογένεια της τερματικής αλληλουχίας κατά τη διάρκεια μακροχρόνιας εμμονής, υποδηλώνοντας ότι οι cis-δρώσες τερματικές περιοχές είναι μεταβλητές αλλά λειτουργικά ανεκτές σε όλες τις καταστάσεις μόλυνσης[11].
Για τη συνοπτική περιγραφή της αρχιτεκτονικής του γονιδιώματος και της γονιδιακής έκφρασης, όπως περιγράφεται σε αυτές τις πηγές, ο παρακάτω πίνακας αντιπαραβάλλει ορισμένα συχνά αναφερόμενα οργανωτικά χαρακτηριστικά.
Μεταγραφή και γονιδιακή έκφραση
Η γονιδιακή έκφραση του Bornavirus στον BDV περιλαμβάνει πολλαπλά πολυαδενυλιωμένα υπογονιδιωματικά RNA συμπληρωματικά προς το γονιδίωμα αρνητικής πολικότητας, με μια μελέτη να ταυτοποιεί εννέα είδη πολυαδενυλιωμένων υπογονιδιωματικών RNA, συμπεριλαμβανομένων έξι πολυκιστρονικών poly(A)+ RNA και μονοκιστρονικών mRNA που αντιστοιχούν στα ORF I, II και IV[4]. Στην ίδια ανάλυση, δεν ανιχνεύθηκαν μονοκιστρονικά poly(A)+ RNA για τα ORF III και V, υποδηλώνοντας ότι η έκφραση ορισμένων κωδικοποιουσών περιοχών δεν κυριαρχείται από απλά μονοκιστρονικά μηνύματα στον BDV[4]. Οι αναλύσεις Northern έδειξαν επίσης ότι ο BDV μεταγράφει τόσο μονο- όσο και πολυκιστρονικά RNA και χρησιμοποιεί σήματα τερματισμού/πολυαδενυλίωσης που θυμίζουν άλλους RNA ιούς αρνητικού κλώνου, συμβατά με ένα μεταγραφικό πρόγραμμα «στάσης-έναρξης» (stop-start) που παρ' όλα αυτά αποδίδει συχνή συνέχεια μεταγραφής πέραν των θέσεων τερματισμού[5].
Ο τερματισμός και η πολυαδενυλίωση περιλαμβάνουν διακριτές θέσεις και ένα αναγνωρίσιμο σήμα. Πειράματα υβριδισμού Northern υποστήριξαν τη χρήση ειδικών θέσεων τερματισμού (T2, T3, T5 και T7) και ταυτοποίησαν μια συναινετική αλληλουχία σήματος τερματισμού/πολυαδενυλίωσης, παρέχοντας μοριακά ορόσημα για τα όρια των μεταγραφημάτων και την τάση για readthrough[5]. Ο BDV είναι επίσης αξιοσημείωτος για την υψηλή συχνότητα μεταγραφημάτων readthrough σε σχέση με άλλους RNA ιούς αρνητικού κλώνου, υποδηλώνοντας ότι η αποτελεσματικότητα του τερματισμού είναι συστηματικά ρυθμισμένη και μπορεί να είναι μηχανιστικά απαραίτητη[5]. Πράγματι, το readthrough του T3 είναι απαραίτητο για την έκφραση της p190 (πρωτεΐνη πολυμεράσης), συνδέοντας άμεσα την καταστολή του τερματισμού με τη διαθεσιμότητα της πολυμεράσης και, ως εκ τούτου, με την ικανότητα αναδιπλασιασμού και μεταγραφής[9].
Τα mRNA του BDV διαθέτουν κάλυμμα (capped) και είναι πολυαδενυλιωμένα, αποδεικνύοντας ότι η ωρίμανση του mRNA είναι συμβατή με την παραγωγή RNA ικανών για μετάφραση παρά την πυρηνική θέση αναδιπλασιασμού[19]. Πρόσθετη κωδικωτική ποικιλομορφία δημιουργείται από το μάτισμα (splicing), καθώς τα RNA των 2.8-kb και 7.1-kb περιέχουν δύο εσώνια (introns) που υφίστανται διαφορικό μάτισμα για να δώσουν RNA που κωδικοποιούν πολλαπλά προϊόντα, συμπεριλαμβανομένων της G και πρωτεϊνών που σχετίζονται με την πολυμεράση, ενώ χωριστές αναφορές υποδηλώνουν ότι η έκφραση της L απαιτεί μάτισμα και καταστολή του τερματισμού[6, 10]. Στο επίπεδο της έναρξης και της δομής του προαγωγέα, η τέλεια τερματική συμπληρωματικότητα δεν φαίνεται να απαιτείται για υψηλή δραστηριότητα του προαγωγέα, και η αυξημένη τερματική συμπληρωματικότητα δεν προώθησε τον αναδιπλασιασμό έναντι της μεταγραφής από την πολυμεράση του BDV, υποδηλώνοντας ότι η ισορροπία αναδιπλασιασμού-μεταγραφής δεν είναι απλώς συνάρτηση της ισχύος της τερματικής σύζευξης βάσεων[11].
Επισκόπηση κύκλου αναδιπλασιασμού
Ο αναδιπλασιασμός του Bornavirus καθορίζεται από την πυρηνική σύνθεση RNA και την πυρηνική οργάνωση των ιικών RNP. Πολλαπλές πηγές παρέχουν στοιχεία ότι ο αναδιπλασιασμός και η μεταγραφή του BDV συμβαίνουν στον πυρήνα σε συνεργασία με λοιμογόνα BDV-RNPs, καθιερώνοντας ότι το λειτουργικό πρότυπο για τη σύνθεση RNA είναι ένα σύμπλοκο RNP που λειτουργεί στο πυρηνικό περιβάλλον[4, 13]. Πειράματα ποσοτικής κλασμάτωσης και σήμανσης έδειξαν περαιτέρω ότι το μεγαλύτερο μέρος του νεοσυντιθέμενου BDV RNA γονιδιωματικής πολικότητας είναι poly(A)− και πυρηνικό, υποστηρίζοντας το συμπέρασμα ότι ο αναδιπλασιασμός του γονιδιώματος λαμβάνει χώρα στον πυρήνα των μολυσμένων κυττάρων[13].
Ένα συνεπές πρότυπο διαμερισματοποίησης αναδύεται για τις διαφορετικές κατηγορίες ιικού RNA. Το BDV RNA των 9-kb poly(A)− είναι κυρίως πυρηνικό, ενώ τα νεοσυντιθέμενα poly(A)+ RNA μεταφέρονται στο κυτταροπλασματικό διαμέρισμα, υποδηλώνοντας ότι η εξαγωγή του mRNA και η κατακράτηση του γονιδιώματος διαχωρίζονται μέσω του πυρηνικού φακέλου[13, 14]. Η μεταφορά των mRNA του BDV έχει αποδειχθεί ότι εξαρτάται από την ενέργεια, υποδηλώνοντας την ενεργή εξαγωγή αντί για την παθητική διάχυση ως βασικό σημείο ελέγχου για τη γονιδιακή έκφραση στη μόλυνση από Bornavirus στον πυρήνα[20].
Οι Bornaviruses συναρμολογούν επίσης πυρηνικά ιικά εργοστάσια που περιγράφονται ως «ιικά Speckles Of Transcripts» (vSPOTs), παρέχοντας ένα δομικό πλαίσιο για συγκεντρωμένη μεταγραφή/αναδιπλασιασμό και δυνητικά συντονισμένη επεξεργασία RNA στον πυρήνα[1]. Στον BoDV-1, τα vSPOTs που σχηματίζονται από τον διαχωρισμό φάσης υγρού-υγρού που καθοδηγείται από την πρωτεΐνη P υπάρχουν στον πυρήνα και αλληλεπιδρούν στενά με τη χρωματίνη, συμπεριλαμβανομένης της πρόσδεσης σε δίκλωνες θραύσεις του νευρωνικού DNA, συνδέοντας τις θέσεις αναδιπλασιασμού με συγκεκριμένες πυρηνικές υποδομές[3]. Σε συμφωνία με την κεντρική σημασία των RNP, συμπλέγματα BDV-RNP που περιέχουν μόνο το είδος RNA των 9-kb έχουν αναφερθεί ότι διαθέτουν τη δραστηριότητα πολυμεράσης που απαιτείται για τη μεταγραφή και ότι μεταφέρουν τις γενετικές πληροφορίες που χρειάζονται για να κατευθύνουν τη σύνθεση των μακρομορίων του BDV και την παραγωγή λοιμογόνων σωματιδίων BDV, συνδέοντας τα RNP γονιδιωματικού μήκους με τα επόμενα στάδια στον κύκλο ζωής του ιού[21].
Μηχανισμός RNP και πολυμεράσης
Το BDV RNA γονιδιωματικού μήκους είναι συσκευασμένο σε συμπλέγματα RNP που περιέχουν την N και το ιικό σύμπλοκο RNA-εξαρτώμενης RNA πολυμεράσης, ορίζοντας τον βασικό μηχανισμό ως ένα πρότυπο νουκλεοκαψιδίου συνδεδεμένο με το σύμπλοκο πολυμεράσης[15]. Το σύμπλοκο RdRp αποτελείται από τις P και L και είναι υπεύθυνο για τον αναδιπλασιασμό και τη μεταγραφή του ιικού γονιδιώματος, καθιερώνοντας την L ως την καταλυτική υπομονάδα και την P ως έναν απαραίτητο συμπαράγοντα της πολυμεράσης στον BDV[15]. Δομικές και λειτουργικές περιγραφές ορίζουν περαιτέρω την L ως μια RdRp ~192 kDa που σχηματίζει τον πυρήνα του συμπλόκου αναδιπλασιασμού, εκτελώντας τη μεταγραφή και τον αναδιπλασιασμό για την παραγωγή ιικού mRNA και νέων αντιγράφων του γονιδιώματος, και συνδέεται με την P για αποτελεσματική σύνθεση RNA[16].
Οι ιδιότητες πρωτεϊνικής αλληλεπίδρασης της P παρέχουν μηχανιστική εικόνα για τη λειτουργία της πολυμεράσης. Η P αυτοσυνδέεται σε ολιγομερή μέσω μιας κεντρικής περιοχής ολιγομερισμού και γεφυρώνει την RdRp με το νουκλεοκαψίδιο, ενώ λειτουργεί επίσης ως συνοδός (chaperone) για την N προκειμένου να τη διατηρήσει σε μια μορφή ελεύθερη από RNA που απαιτείται για τον αναδιπλασιασμό, υποστηρίζοντας ένα μοντέλο στο οποίο η P συντονίζει τόσο τη στρατολόγηση του ενζύμου όσο και την ετοιμότητα του προτύπου[3]. Αντίστοιχα, η πειραματική διακοπή του ολιγομερισμού της P σε μια δοκιμασία μινι-ρεπλίκοντος εξέτασε εάν μεταλλάγματα της P με έλλειψη ολιγομερισμού θα μπορούσαν να ανασυστήσουν λειτουργικά συμπλέγματα πολυμεράσης, και κανένα από τα μεταλλάγματα P δεν υποστήριξε την έκφραση του αναφορέα, υποδηλώνοντας ότι ο ολιγομερισμός της P απαιτείται για τη δραστηριότητα της πολυμεράσης υπό αυτές τις συνθήκες[22]. Επιπλέον, η δράση της P ως συμπαράγοντα για την RdRp του BDV ρυθμίζεται αρνητικά μέσω φωσφορυλίωσης, παρέχοντας έναν σαφή μεταφραστικό ρυθμιστικό μοχλό για τη λειτουργία της πολυμεράσης[15].
Οι ισομορφές της πυρηνοπρωτεΐνης του Bornavirus συνδέουν επίσης τη λειτουργία της πρωτεΐνης με τον ενδοκυτταρικό εντοπισμό. Πειράματα που εξέφρασαν τις p40 και p38 έδειξαν ότι η p40 είναι κυρίως πυρηνική ενώ η p38 είναι κυρίως κυτταροπλασματική, ωστόσο και οι δύο δεσμεύουν τη φωσφοπρωτεΐνη P του BDV, υποδηλώνοντας ότι ο εξαρτώμενος από την ισομορφή εντοπισμός σε συνδυασμό με τη δέσμευση της P μπορεί να ρυθμίζει το πού συμβαίνει η συναρμολόγηση ή/και η λειτουργία των RNP[9]. Σε συμφωνία με έναν ρόλο πυρηνικής στόχευσης για την P, η P περιέχει ένα ισχυρό διμερές σήμα πυρηνικού εντοπισμού (NLS) στο αμινοτελικό της άκρο και πρόσθετα ασθενέστερα μοτίβα NLS, υποστηρίζοντας την πυρηνική εισαγωγή των συμπλεγμάτων που περιέχουν πολυμεράση ως μηχανιστική προϋπόθεση για την πυρηνική σύνθεση RNA[9].
Τέλος, η βοηθητική πρωτεΐνη X μπορεί να μειώσει άμεσα τη σύνθεση RNA σε ανασυσταθέντα συστήματα. Όταν συμπλέγματα πολυμεράσης του BDV ανασυστάθηκαν σε κύτταρα που εκφράζουν την πρωτεΐνη X, δεν ανιχνεύθηκε plus-strand RNA μινι-γονιδιώματος, υποδηλώνοντας ότι η X αναστέλλει τόσο την ιική μεταγραφή όσο και τον αναδιπλασιασμό σε αυτό το πειραματικό πλαίσιο[23]. Αυτές οι παρατηρήσεις μαζί υποστηρίζουν ένα μοντέλο μηχανισμού στο οποίο οι L και P σχηματίζουν τον καταλυτικό πυρήνα, ο ολιγομερισμός και η φωσφορυλίωση της P ρυθμίζουν την ικανότητα της πολυμεράσης, και βοηθητικοί παράγοντες όπως η X μπορούν να καταστείλουν την απόδοση της πολυμεράσης υπό καθορισμένες συνθήκες[15, 23].
Πυρηνική διακίνηση
Οι Bornaviruses συνδέουν τον πυρηνικό αναδιπλασιασμό με τη ρυθμιζόμενη πυρηνοκυτταροπλασματική διακίνηση των συστατικών RNP και των ειδών RNA. Άμεσες αποδείξεις δείχνουν ότι ο αναδιπλασιασμός και η μεταγραφή του BDV λαμβάνουν χώρα στους πυρήνες όπου υπάρχουν λοιμογόνα BDV RNPs, και η κλασμάτωση δείχνει ότι το νεοσυντιθέμενο RNA γονιδιωματικής πολικότητας είναι ισχυρά εμπλουτισμένο στο πυρηνικό κλάσμα, παρέχοντας μια λειτουργική ώθηση για τις οδούς πυρηνικής εισαγωγής και εξαγωγής προκειμένου να συντονίσουν τον κύκλο ζωής[13, 21]. Δοκιμασίες μεταφοράς RNA δείχνουν ότι τα νεοσυντιθέμενα poly(A)+ RNA του BDV μεταφέρονται αποτελεσματικά στο κυτταροπλασματικό διαμέρισμα ενώ το γονιδιωματικό RNA των 9-kb παραμένει κυρίως πυρηνικό, αποδεικνύοντας μια συμπεριφορά εξαγωγής ειδική για την κατηγορία του RNA[14]. Επιπλέον, η μεταφορά του mRNA εξαρτάται από την ενέργεια, με αμελητέα εξαγωγή απουσία ATP, υποστηρίζοντας ενεργούς, εξαρτώμενους από παράγοντες του ξενιστή μηχανισμούς εξαγωγής για τα ιικά mRNA[20].
Όσον αφορά τη διακίνηση πρωτεϊνών, η εξαρτώμενη από την CRM1 εξαγωγή εμπλέκεται για την πυρηνοπρωτεΐνη. Η πυρηνική εξαγωγή της N πραγματοποιείται μέσω μιας οδού εξαρτώμενης από την CRM1 που συνάδει με ένα NES, και μια ξεχωριστή αναφορά αναφέρει ομοίως ότι η πυρηνική εξαγωγή της BoDV-N συμβαίνει μέσω μιας οδού εξαρτώμενης από την CRM1, υποδηλώνοντας τη διατήρηση αυτής της οδού εξαγωγής εντός των Bornaviruses[15, 24]. Ευρύτερες ανασκοπήσεις αναφέρουν περαιτέρω ότι αρκετές πρωτεΐνες του BDV (συμπεριλαμβανομένης της πυρηνοπρωτεΐνης, της φωσφοπρωτεΐνης, της X και της L) συμβάλλουν στην πυρηνοκυτταροπλασματική διακίνηση του BDV RNP, και ότι ο κατευθυντικός έλεγχος πιθανώς καθορίζεται από τις αναλογίες και τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των στοιχείων NLS και NES στο RNP, πλαισιώνοντας τη διακίνηση ως μια αναδυόμενη ιδιότητα ανταγωνιστικών σημάτων εντοπισμού και όχι ως έναν μοναδικό καθοριστικό παράγοντα[25].
Ο σχηματισμός πυρηνικών ιικών εργοστασίων παρέχει ένα πρόσθετο επίπεδο οργάνωσης σχετικό με τη διακίνηση. Οι Bornaviruses συναρμολογούν vSPOTs στον πυρήνα, και τα vSPOTs του BoDV-1 σχηματίζονται από τον διαχωρισμό φάσης υγρού-υγρού που καθοδηγείται από την πρωτεΐνη P και αλληλεπιδρούν στενά με τη χρωματίνη, η οποία μπορεί να περιορίσει τη διάχυση και δυνητικά να κατευθύνει την τοποθέτηση των θέσεων μεταγραφής/αναδιπλασιασμού σε σχέση με τα πυρηνικά ορόσημα του ξενιστή[1, 3].
Αντίστροφη γενετική και στοιχεία προαγωγέα
Τα cis-δρώντα ρυθμιστικά σήματα του Bornavirus συγκεντρώνονται στις μη μεταφραζόμενες οριακές και τερματικές περιοχές. Στον BDV, τα ORF πλαισιώνονται από μη μεταφραζόμενες οριακές αλληλουχίες που περιέχουν ρυθμιστικά σήματα για την έναρξη και τη διακοπή της μεταγραφής, σε συμφωνία με μια αρχιτεκτονική τύπου Mononegavirales με σήματα έναρξης και τέλους γονιδίου που καθοδηγούν τη συμπεριφορά της πολυμεράσης κατά μήκος του γονιδιώματος[8]. Μια συμπερασματική συναινετική αλληλουχία έναρξης του BDV (UNCNNNUUNN) είναι πανομοιότυπη με εκείνη που προκύπτει από τη σύγκριση NNS-RNA ιών σε πολλαπλές οικογένειες Mononegavirales, υποστηρίζοντας τη διατήρηση του μοτίβου έναρξης που χρησιμοποιείται από τον μηχανισμό της πολυμεράσης[4, 17]. Τα σήματα τερματισμού/πολυαδενυλίωσης περιλαμβάνουν ένα συντηρημένο εξάμερες AUUUUU στο 5′ άκρο κάθε σήματος τερματισμού/πολυαδενυλίωσης ακολουθούμενο από GG (ή CG στο ORF II), ενώ πιθανά σήματα δεν μπόρεσαν να ταυτοποιηθούν για το ORF III σε μία ανάλυση, υποδεικνύοντας τόσο τη διατήρηση όσο και κενά στην ανιχνευσιμότητα των μοτίβων στα όρια των γονιδίων[4].
Προσεγγίσεις αντίστροφης γενετικής και μινι-γονιδιώματος έχουν ελέγξει άμεσα αυτά τα ρυθμιστικά στοιχεία. Ένα σύστημα RNA πολυμεράσης Ι/πολυμεράσης ΙΙ δημιουργήθηκε για την ενδοκυτταρική ανασύσταση του αναδιπλασιασμού και της μεταγραφής του BDV RNA, επιτρέποντας την ελεγχόμενη ανάλυση των cis- και trans-δρώντων απαιτήσεων[11]. Σε αυτό το σύστημα, ένα ανάλογο BDV RNA (μινι-γονιδίωμα) συντίθεται από την κυτταρική RNA πολυμεράση Ι και περιέχει τις 5′ και 3′ μη μεταφραζόμενες cis-δρώσες αλληλουχίες του BDV που απαιτούνται για τη σύνθεση RNA μέσω της πολυμεράσης του BDV, συνδέοντας τις τερματικές περιοχές με τη λειτουργία του προαγωγέα στα κύτταρα[11]. Ο εγκλεισμός του προερχόμενου από την πολυμεράση Ι RNA μινι-γονιδιώματος στο καψίδιο από τις BDV N και P που παρέχονται από πλασμίδια δημιουργεί ένα πρότυπο που αναγνωρίζεται από την ανασυσταθείσα πολυμεράση του BDV για να κατευθύνει τη σύνθεση RNA αντι-μινι-γονιδιώματος πλήρους μήκους (αναδιπλασιασμός) και ενός υπογονιδιωματικού mRNA που κωδικοποιεί ένα γονιδίωμα αναφοράς (reporter gene), αποδεικνύοντας πειραματικά ότι ο εγκλεισμός από τις N και P είναι επαρκής για να καταστήσει το RNA ικανό για αναγνώριση από την πολυμεράση και σύνθεση RNA διπλής εξόδου[11].
Η χαρτογράφηση του προαγωγέα αποσαφηνίζει περαιτέρω το cis-δρων μοντέλο. Αλληλουχίες προς τα κάτω (νουκλεοτίδια 25 έως 33) απαιτήθηκαν για τη βέλτιστη δραστηριότητα του προαγωγέα, και η διαγραφή των νουκλεοτιδίων 34 έως 35 κατάργησε τη δραστηριότητα του αναφορέα σε αυτό το πλαίσιο, ταυτοποιώντας σύντομες, εξαρτώμενες από τη θέση απαιτήσεις εγγύς του προαγωγέα στην 3′ γονιδιωματική περιοχή του προαγωγέα[12]. Μαζί, αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν μια αρχιτεκτονική προαγωγέα στην οποία οι συμπαγείς τερματικές αλληλουχίες και τα κοντινά στοιχεία προς τα κάτω διέπουν την έναρξη και τον παραγωγικό αναδιπλασιασμό/μεταγραφή στο ανασυσταθέν σύστημα πολυμεράσης[11, 12].
Μηχανισμοί εμμονής
Η μοριακή εμμονή (persistence) του Bornavirus συνδέεται με τη δυναμική των άκρων του γονιδιώματος, τον πυρηνικό αναδιπλασιασμό και την εξειδικευμένη πυρηνική οργάνωση. Μια διαδικασία «επαναευθυγράμμισης και επιμήκυνσης» (realign-and-elongation) ανανεώνει τα 3′ άκρα των μορίων v- και cRNA από εσωτερικά πρότυπα κατά τη διάρκεια κάθε γύρου αναδιπλασιασμού και μπορεί να συμβεί μόνο εάν τα άκρα είναι πλήρη, παρέχοντας ένα σαφές μηχανιστικό βήμα που δρα ως σημείο ελέγχου ποιότητας για την ακεραιότητα του γονιδιώματος[26]. Αυτή η διαδικασία παρέχει έναν ενσωματωμένο έλεγχο ποιότητας που καταστέλλει τον αναδιπλασιασμό μορίων RNA με τερματικές διαγραφές, συνδέοντας τη λογική της επιδιόρθωσης των άκρων με την επιλογή κατά των ελαττωματικών ενδιάμεσων αναδιπλασιασμού[26]. Παράλληλα, αναλύσεις των γονιδιωματικών άκρων κατά τη διάρκεια μακροχρόνιας εμμονικής μόλυνσης ανέφεραν υψηλότερο βαθμό τερματικής ετερογένειας στα RNA από εμμονικά μολυσμένα κύτταρα σε σύγκριση με οξείες χρονικές στιγμές, υποδεικνύοντας ότι η εμμονή συνοδεύεται από μετατοπίσεις στην κατανομή των παραλλαγών των γονιδιωματικών άκρων[11].
Η εμμονή σχετίζεται επίσης με το σταθερό πυρηνικό πλαίσιο για τα RNP. Οι Bornaviruses έχουν περιγραφεί ως μοναδικοί μεταξύ των γνωστών ζωικών NNS RNA ιών που αναδιπλασιάζονται και μεταγράφονται στον πυρήνα, ο οποίος παρέχει το περιβάλλον κυτταρικής διαμερισματοποίησης για τη μακροχρόνια μη κυτταρολυτική σύνθεση RNA και την επεξεργασία των πυρηνικών γονιδιωματικών άκρων[2]. Επιπλέον, ο BoDV-1 κατασκευάζει τα vRNP του χρησιμοποιώντας τη χρωματίνη του ξενιστή ως ικρίωμα, μια ιδιότητα που μπορεί μηχανιστικά να υποστηρίξει την εμμονή στον πυρήνα σταθεροποιώντας την τοποθέτηση των vRNP σε σχέση με τη χρωματίνη[27].
Η τροποποίηση της απόκρισης του ξενιστή έχει επίσης συνδεθεί πειραματικά με τις καταστάσεις μόλυνσης. Τα μολυσμένα με BDV κύτταρα εξέκριναν λιγότερη SEAP από τα εικονικά (mock) κύτταρα μετά από ενεργοποίηση με Pam3CSK4, υποδηλώνοντας ότι τα μολυσμένα με BDV κύτταρα καταστέλλουν ενεργά τη σηματοδότηση NF-κB, γεγονός που παρέχει έναν μοριακό συσχετισμό για την αλλοιωμένη εγγενή σηματοδότηση κατά τη διάρκεια της εμμονικής μόλυνσης[28].
Ανοικτά ερωτήματα
Αρκετά μοριακά ερωτήματα παραμένουν ανοικτά ή είναι έτοιμα για στοχευμένο πειραματισμό με βάση τα μηχανιστικά ευρήματα που συνοψίστηκαν παραπάνω.
- Ποιοι αλληλουχιακοί και δομικοί καθοριστικοί παράγοντες ελέγχουν την αποτελεσματικότητα τερματισμού του BDV και την υψηλή συχνότητα των μεταγραφημάτων readthrough, ιδιαίτερα στη θέση T3 όπου το readthrough είναι απαραίτητο για την έκφραση της πολυμεράσης[5, 9];
- Πώς αλληλεπιδρούν τα γεγονότα εναλλακτικού ματίσματος στα RNA των 2.8-kb και 7.1-kb με τη χρήση των μεταγραφικών ορίων για την απόδοση των σωστών στοιχειομετριών της G και των προϊόντων που σχετίζονται με την πολυμεράση, συμπεριλαμβανομένων των περιπτώσεων όπου η έκφραση της L απαιτεί μάτισμα και καταστολή του τερματισμού[6, 10];
- Ποια είναι η ποσοτική σχέση μεταξύ της τερματικής ετερογένειας που παρατηρείται κατά την εμμονή και της δραστηριότητας του προαγωγέα, δεδομένου ότι η τέλεια τερματική συμπληρωματικότητα δεν απαιτείται για υψηλή δραστηριότητα προαγωγέα και τα άκρα διαφοροποιούνται κατά τη διάρκεια μακροχρόνιας μόλυνσης[11];
- Πώς συντονίζεται το βήμα ελέγχου ποιότητας «επαναευθυγράμμισης και επιμήκυνσης» με την πυρηνική οργάνωση των RNP, δεδομένου ότι η ανανέωση των 3′ άκρων προέρχεται από εσωτερικά πρότυπα και καταστέλλει τον αναδιπλασιασμό των RNA με τερματικές διαγραφές[26];
- Ποιοι παράγοντες του ξενιστή και ποια πυρηνικά ορόσημα διέπουν τον σχηματισμό και την τοποθέτηση των vSPOTs που δημιουργούνται από τον διαχωρισμό φάσης υπό την καθοδήγηση της P, τα οποία αλληλεπιδρούν με τη χρωματίνη και προσδένονται σε δίκλωνες θραύσεις του νευρωνικού DNA[3];
- Πώς ενσωματώνονται η εξαρτώμενη από την CRM1 εξαγωγή της πυρηνοπρωτεΐνης και η εξαρτώμενη από την ενέργεια εξαγωγή mRNA για τη ρύθμιση της διαμερισματοποίησης των poly(A)+ RNA έναντι του poly(A)− γονιδιωματικού RNA μέσω του πυρηνικού φακέλου[13, 15, 20];
- Μέσω ποιου μοριακού μηχανισμού η πρωτεΐνη X καταστέλλει τη συσσώρευση RNA μινι-γονιδιώματος, και πώς αυτή η καταστολή διασταυρώνεται με την εξαρτώμενη από τη φωσφορυλίωση της P αρνητική ρύθμιση της δραστηριότητας του συμπαράγοντα της πολυμεράσης[15, 23];
