Abstract
I bornavirus (ad es., Borna disease virus, BDV; Borna disease virus 1, BoDV-1) sono virus a RNA a singolo filamento di senso negativo, non segmentati, la cui caratteristica più distintiva tra i virus a RNA a filamento negativo non segmentato (NNS-RNA) animali è che la trascrizione e la replicazione del genoma avvengono nel nucleo della cellula ospite anziché prevalentemente nel citoplasma[1–3]. Studi molecolari su BDV hanno definito un genoma compatto di ~8.9–9 kb con molteplici open reading frames organizzate in un piccolo numero di unità di trascrizione e fiancheggiate da sequenze terminali extracistroniche che fungono da promotori e confini regolatori per la sintesi dell'RNA virale[4–8]. L'espressione genica è complessa e include la produzione di RNA poly(A)+ sia mono- che policistronici, frequenti readthrough nei siti di terminazione e l'uso dello splicing per l'espressione di prodotti chiave, inclusa la polimerasi (L) in alcuni contesti di trascrizione[4–6, 9, 10]. I sistemi di ricostituzione funzionale e di minigenoma hanno mappato i requisiti del promotore cis-agente nell'estremità genomica 3' e hanno dimostrato che N e P incapsidano i template riconosciuti dal complesso polimerasico L/P per generare sia prodotti replicativi che trascritti[11, 12]. L'organizzazione e il traffico nucleare modellano ulteriormente il programma di replicazione, con i "vSPOTs" virali (speckles of transcripts) e l'esportazione di nucleoproteine dipendente da CRM1 che contribuiscono alla dinamica delle RNP e alla compartimentazione degli RNA virali poly(A)+ rispetto a quelli poly(A)−[3, 13–15].
Keywords
- Bornavirus[1]
- Borna disease virus[4]
- nonsegmented negative-strand RNA virus[4]
- replicazione nucleare[2]
- readthrough trascrizionale[5]
- vSPOTs[3]
- minigenome[11]
- esportazione CRM1[15]
- fosfoproteina P[15]
- RNA-dependent RNA polymerase L[16]
Introduction
I bornavirus sono virus NNS-RNA le cui sequenze consenso del promotore e di inizio del gene si allineano con i pattern osservati tra le famiglie di Mononegavirales, indicando una logica di trascrizione a filamento negativo condivisa a livello degli elementi di inizio cis-agenti[4, 17]. Una distinzione meccanicistica centrale è che, mentre la maggior parte dei mononegavirus si replica principalmente nel citoplasma, i bornavirus si replicano nel nucleo, dove stabiliscono siti nucleari specializzati per la sintesi dell'RNA virale[1, 3]. L'evidenza sperimentale supporta specificamente che la replicazione e la trascrizione di BDV avvengono nei nuclei delle cellule infette e sono associate a complessi ribonucleoproteici infettivi (BDV-RNPs), sottolineando che la sintesi dell'RNA bornavirale viene eseguita nel contesto delle RNP nucleari[4, 13]. La localizzazione nucleare è ulteriormente supportata dal frazionamento cellulare che mostra come la maggior parte dell'RNA di BDV a polarità genomica neosintetizzato sia poly(A)− e si trovi in gran parte nella frazione nucleare, coerentemente con la replicazione nucleare dell'RNA genomico[13].
Genome organization
Il sequenziamento e la mappatura del genoma di BDV hanno identificato un genoma lineare di ~8.9 kb con le principali open reading frames predette lungo il genoma e fiancheggiate da sequenze non codificanti ad entrambi i termini[4, 5]. In un report, sono state predette cinque ORF principali (I–V) in una sequenza genomica di BDV di 8,903-nt, mentre un'altra descrizione del genoma di BDV (8,910 nt) ha similmente notato informazioni antisenso per cinque ORF principali fiancheggiate da 53 nt di sequenza non codificante al termine 3' e 91 nt al termine 5'[4, 5]. Oltre all'inquadramento a cinque ORF, la mappatura a livello antigenomico ha descritto tre unità di trascrizione e sei ORF, e i riassunti a livello di review descrivono parimenti BDV come codificante sei ORF in tre unità di trascrizione incorniciate da termini complementari che ricordano altri virus NNS RNA[6, 7].
La regione codificante più grande (ORF V) codifica una proteina predetta di ~170 kDa con forte omologia con la famiglia delle proteine L delle polimerasi dei virus NNS-RNA, collocando l'RNA polimerasi RNA-dipendente virale all'estremità 5'-prossimale del set genico nel layout canonico a filamento negativo[4]. L'analisi delle sequenze conservate ha identificato la massima omologia in un presunto dominio catalitico con residui invarianti e conservati raggruppati in quattro motivi altamente conservati (A–D), coerentemente con i vincoli enzimatici conservati sulla funzione della polimerasi tra i virus NNS-RNA[18]. È stato riportato che le BDV-RNPs infettive contengono solo una specie di RNA di BDV, l'RNA da 9-kb a polarità negativa, poly(A)−, a supporto del fatto che l'RNA poly(A)− a lunghezza genomica è la specie template incapsidata nelle RNP infettive[13].
I genomi dei bornavirus possiedono anche regioni di confine regolatorie tipiche dei virus NNS-RNA, con ORF fiancheggiate da sequenze di confine non traslate che includono segnali di inizio e di arresto della trascrizione[8]. Le sequenze terminali possono appaiarsi per formare una struttura a "panhandle" e in BDV l'allineamento dei termini genomici ha permesso la formazione di un panhandle terminale con i primi 3 nucleotidi non appaiati, collegando la complementarità terminale all'architettura del promotore senza richiedere un duplex perfetto[5]. È importante notare che le analisi dei termini genomici di BDV hanno riportato sia la mancanza di una perfetta complementarità terminale sia una maggiore eterogeneità della sequenza terminale durante la persistenza a lungo termine, indicando che le regioni terminali cis-agenti sono variabili ma funzionalmente tollerate attraverso i vari stati di infezione[11].
Per riassumere sinteticamente l'architettura del genoma e dell'espressione genica come descritto in queste fonti, la tabella seguente mette a confronto diverse caratteristiche organizzative frequentemente citate.
Transcription and gene expression
L'espressione genica dei bornavirus in BDV include molteplici RNA subgenomici poliadenilati complementari al genoma a senso negativo; uno studio ha identificato nove specie di RNA subgenomici poliadenilati, inclusi sei RNA poly(A)+ policistronici e mRNA monocistronici corrispondenti alle ORF I, II e IV[4]. Nella stessa analisi, gli RNA poly(A)+ monocistronici per le ORF III e V non sono stati rilevati, indicando che l'espressione di alcune regioni codificanti non è dominata da semplici messaggi monocistronici in BDV[4]. Le analisi Northern hanno anche mostrato che BDV trascrive RNA sia mono- che policistronici e utilizza segnali di terminazione/poliadenilazione che ricordano altri virus a RNA a filamento negativo, coerentemente con un programma trascrizionale stop–start che tuttavia produce una frequente continuità dei trascritti oltre i siti di terminazione[5].
La terminazione e la poliadenilazione coinvolgono siti discreti e un segnale riconoscibile. Esperimenti di ibridazione Northern hanno supportato l'uso di siti di terminazione specifici (T2, T3, T5 e T7) e hanno identificato una sequenza consenso del segnale di terminazione/poliadenilazione, fornendo riferimenti molecolari per i confini dei trascritti e la propensione al readthrough[5]. BDV è anche noto per l'elevata frequenza di trascritti di readthrough rispetto ad altri virus a RNA a filamento negativo, il che implica che l'efficienza di terminazione è sistematicamente regolata e può essere meccanicisticamente essenziale[5]. Infatti, il readthrough di T3 è essenziale per l'espressione di p190 (proteina polimerasica), collegando direttamente la soppressione della terminazione alla disponibilità della polimerasi e quindi alla capacità di replicazione e trascrizione[9].
Gli mRNA di BDV presentano cap e poliadenilazione, dimostrando che la maturazione dell'mRNA è coerente con la produzione di RNA competenti per la traduzione nonostante la nicchia di replicazione nucleare[19]. Un'ulteriore diversità codificante è generata dallo splicing, poiché gli RNA da 2.8-kb e 7.1-kb contengono due introni che vengono sottoposti a splicing differenziale per produrre RNA che codificano molteplici prodotti, incluse la proteina G e le proteine correlate alla polimerasi; dichiarazioni separate indicano che l'espressione di L richiede lo splicing e la soppressione della terminazione[6, 10]. A livello di inizio e struttura del promotore, la perfetta complementarità terminale non sembra essere richiesta per un'elevata attività del promotore, e l'aumento della complementarità terminale non ha promosso la replicazione rispetto alla trascrizione da parte della polimerasi di BDV, indicando che l'equilibrio replicazione-trascrizione non è semplicemente una funzione della forza di appaiamento delle basi terminali[11].
Replication cycle overview
La replicazione dei bornavirus è definita dalla sintesi dell'RNA nucleare e dall'organizzazione nucleare delle RNP virali. Molteplici fonti forniscono prove del fatto che la replicazione e la trascrizione di BDV avvengano nel nucleo in associazione con BDV-RNPs infettive, stabilendo che il template funzionale per la sintesi dell'RNA è un complesso RNP operante nell'ambiente nucleare[4, 13]. Esperimenti quantitativi di frazionamento e marcatura hanno inoltre mostrato che la maggior parte dell'RNA a polarità genomica di BDV neosintetizzato è poly(A)− e nucleare, supportando la conclusione che la replicazione del genoma avvenga nel nucleo delle cellule infette[13].
Emerge un pattern di compartimentazione coerente per le diverse classi di RNA virale. L'RNA di BDV da 9-kb poly(A)− è in gran parte nucleare, mentre gli RNA poly(A)+ neosintetizzati vengono trasportati nel compartimento citoplasmatico, indicando che l'esportazione di mRNA e la ritenzione del genoma sono separate attraverso l'involucro nucleare[13, 14]. È stato dimostrato che il trasporto degli mRNA di BDV è dipendente dall'energia, il che implica un'esportazione attiva piuttosto che una diffusione passiva come punto di controllo chiave per l'espressione genica nell'infezione nucleare da bornavirus[20].
I bornavirus assemblano anche fabbriche virali nucleari descritte come "vSPOTs" (viral Speckles Of Transcripts), fornendo un contesto strutturale per la trascrizione/replicazione concentrata e potenzialmente per il processamento coordinato dell'RNA nel nucleo[1]. In BoDV-1, i vSPOTs formati dalla separazione di fase liquido-liquido guidata dalla proteina P sono presenti nel nucleo e interagiscono strettamente con la cromatina, incluso il docking sulle rotture del DNA neuronale a doppio filamento, collegando i siti di replicazione a specifiche sottostrutture nucleari[3]. Coerentemente con la centralità delle RNP, è stato riportato che i complessi BDV-RNP contenenti solo la specie RNA da 9-kb possiedono l'attività polimerasica necessaria per la trascrizione e trasportano le informazioni genetiche necessarie per dirigere la sintesi delle macromolecole di BDV e la produzione di particelle infettive di BDV, collegando le RNP a lunghezza genomica alle fasi successive del ciclo vitale virale[21].
RNP and polymerase machinery
L'RNA a lunghezza genomica di BDV è impacchettato in complessi RNP che contengono N e il complesso dell'RNA polimerasi RNA-dipendente virale, definendo il macchinario centrale come un template nucleocapsidico legato dal complesso polimerasico[15]. Il complesso RdRp è costituito da P e L ed è responsabile della replicazione e della trascrizione del genoma virale, stabilendo L come sottounità catalitica e P come cofattore essenziale della polimerasi in BDV[15]. Le descrizioni strutturali e funzionali definiscono ulteriormente L come una RdRp di ~192 kDa che forma il nucleo del complesso di replicazione, eseguendo la trascrizione e la replicazione per produrre mRNA virale e nuove copie del genoma, e associandosi a P per un'efficiente sintesi dell'RNA[16].
Le proprietà di interazione proteica di P forniscono approfondimenti meccanicistici sulla funzione della polimerasi. P si auto-associa in oligomeri attraverso un dominio di oligomerizzazione centrale e funge da ponte tra la RdRp e il nucleocapside; agisce inoltre da chaperone per N per mantenerlo in una forma priva di RNA necessaria per la replicazione, supportando un modello in cui P coordina sia il reclutamento dell'enzima che la prontezza del template[3]. Coerentemente, la distruzione sperimentale dell'oligomerizzazione di P in un saggio di minireplicone ha verificato se mutanti di P difettosi nell'oligomerizzazione potessero ricostituire complessi polimerasici funzionali; nessuno dei mutanti di P ha supportato l'espressione del reporter, indicando che l'oligomerizzazione di P è necessaria per l'attività della polimerasi in queste condizioni[22]. Inoltre, l'attività di cofattore di P per la RdRp di BDV è regolata negativamente dalla fosforilazione, fornendo una leva regolatoria post-traduzionale esplicita per la funzione della polimerasi[15].
Le isoforme della nucleoproteina dei bornavirus collegano anche la funzione proteica alla localizzazione intracellulare. Esperimenti che esprimono p40 e p38 hanno mostrato che p40 è principalmente nucleare mentre p38 è principalmente citoplasmatica, tuttavia entrambe legano la fosfoproteina P di BDV, suggerendo che la localizzazione isoforma-dipendente accoppiata al legame con P possa modulare il luogo in cui avviene l'assemblaggio e/o la funzione delle RNP[9]. Coerentemente con un ruolo di targeting nucleare per P, P contiene un forte segnale di localizzazione nucleare (NLS) bipartito al suo ammino-termine e ulteriori motivi NLS più deboli, supportando l'importazione nucleare dei complessi contenenti la polimerasi come prerequisito meccanicistico per la sintesi dell'RNA nucleare[9].
Infine, la proteina accessoria X può modulare direttamente verso il basso la sintesi dell'RNA in sistemi ricostituiti. Quando i complessi polimerasici di BDV sono stati ricostituiti in cellule che esprimevano la proteina X, non è stato rilevato alcun RNA minigenoma a filamento positivo, suggerendo che X inibisca sia la trascrizione che la replicazione virale in quel contesto di saggio[23]. Queste osservazioni supportano insieme un modello di macchinario in cui L e P formano il nucleo catalitico, l'oligomerizzazione e la fosforilazione di P regolano la competenza della polimerasi e fattori accessori come X possono sopprimere l'output della polimerasi in condizioni definite[15, 23].
Nuclear trafficking
I bornavirus accoppiano la replicazione nucleare con un traffico nucleocitoplasmatico regolato dei componenti delle RNP e delle specie di RNA. L'evidenza diretta indica che la replicazione e la trascrizione di BDV avvengono nei nuclei dove sono presenti BDV RNPs infettive, e il frazionamento indica che l'RNA a polarità genomica neosintetizzato è fortemente arricchito nella frazione nucleare, fornendo un impulso funzionale alle vie di importazione ed esportazione nucleare per coordinare il ciclo vitale[13, 21]. I saggi di trasporto dell'RNA indicano che gli RNA poly(A)+ di BDV neosintetizzati sono trasportati efficientemente nel compartimento citoplasmatico mentre l'RNA genomico da 9-kb rimane per lo più nucleare, dimostrando un comportamento di esportazione specifico per la classe di RNA[14]. Inoltre, il trasporto dell'mRNA è dipendente dall'energia, con un'esportazione trascurabile in assenza di ATP, supportando meccanismi di esportazione attivi e dipendenti da fattori dell'ospite per gli mRNA virali[20].
Per quanto riguarda il traffico proteico, l'esportazione dipendente da CRM1 è implicata per la nucleoproteina. L'esportazione nucleare di N avviene tramite una via dipendente da CRM1 coerente con un NES, e una dichiarazione separata riporta similmente che l'esportazione nucleare di BoDV-N avviene tramite una via dipendente da CRM1, indicando la conservazione di questa rotta di esportazione all'interno dei bornavirus[15, 24]. Review più ampie affermano inoltre che diverse proteine di BDV (incluse nucleoproteina, fosfoproteina, X e L) contribuiscono al traffico nucleocitoplasmatico della RNP di BDV, e che il controllo direzionale è probabilmente determinato dai rapporti e dalle interazioni tra gli elementi NLS e NES nella RNP, inquadrando il traffico come una proprietà emergente di segnali di localizzazione in competizione piuttosto che come un singolo determinante[25].
La formazione di fabbriche virali nucleari fornisce un ulteriore livello organizzativo rilevante per il traffico. I bornavirus assemblano vSPOTs nel nucleo, e i vSPOTs di BoDV-1 sono formati dalla separazione di fase liquido-liquido guidata dalla proteina P e interagiscono strettamente con la cromatina, il che può limitare la diffusione e potenzialmente dirigere il posizionamento dei siti di trascrizione/replicazione rispetto ai punti di riferimento nucleari dell'ospite[1, 3].
Reverse genetics and promoter elements
I segnali regolatori cis-agenti dei bornavirus sono concentrati nelle regioni di confine e terminali non traslate. In BDV, le ORF sono fiancheggiate da sequenze di confine non traslate contenenti segnali regolatori per l'inizio e l'arresto della trascrizione, coerentemente con un'architettura simile ai Mononegavirales di segnali di inizio e fine gene che guidano il comportamento della polimerasi lungo il genoma[8]. Una sequenza consenso di inizio dedotta per BDV (UNCNNNUUNN) è identica a quella dedotta confrontando i virus NNS-RNA tra molteplici famiglie di Mononegavirales, supportando la conservazione del motivo di inizio utilizzato dal macchinario polimerasico[4, 17]. I segnali di terminazione/poliadenilazione includono un esamero AUUUUU conservato all'estremità 5' di ogni segnale di terminazione/poliadenilazione seguito da GG (o CG nella ORF II), mentre segnali putativi non hanno potuto essere identificati per la ORF III in un'analisi, indicando sia conservazione che lacune nella rilevabilità dei motivi attraverso i confini genici[4].
Gli approcci di genetica inversa e di minigenoma hanno testato direttamente questi elementi regolatori. È stato stabilito un sistema RNA polimerasi I/polimerasi II per la ricostituzione intracellulare della replicazione e trascrizione dell'RNA di BDV, consentendo una dissezione controllata dei requisiti cis- e trans-agenti[11]. In questo sistema, un analogo dell'RNA di BDV (minigenoma) viene sintetizzato dalla RNA polimerasi I cellulare e contiene sequenze cis-agenti non traslate 5' e 3' di BDV richieste per la sintesi dell'RNA mediata dalla polimerasi di BDV, collegando le regioni terminali alla funzione del promotore nelle cellule[11]. L'incapsidamento dell'RNA minigenoma derivato dalla polimerasi I da parte di N e P di BDV forniti da plasmidi genera un template riconosciuto dalla polimerasi di BDV ricostituita per dirigere la sintesi dell'RNA antiminigenoma a lunghezza intera (replicazione) e di un mRNA subgenomico che codifica un gene reporter, dimostrando sperimentalmente che l'incapsidamento di N e P è sufficiente per rendere l'RNA competente per il riconoscimento della polimerasi e per la sintesi dell'RNA a doppio output[11].
La mappatura del promotore affina ulteriormente il modello cis-agente. Le sequenze a valle (nucleotidi da 25 a 33) erano necessarie per un'attività ottimale del promotore, e la delezione dei nucleotidi da 34 a 35 ha annullato l'attività del reporter in questo contesto, identificando requisiti prossimali al promotore brevi e specifici per la posizione nella regione del promotore genomico 3'[12]. Insieme, questi dati supportano un'architettura del promotore in cui sequenze terminali compatte ed elementi vicini a valle governano l'inizio e la replicazione/trascrizione produttiva nel sistema polimerasico ricostituito[11, 12].
Persistence mechanisms
La persistenza molecolare dei bornavirus è legata alla dinamica delle estremità del genoma, alla replicazione nucleare e all'organizzazione nucleare specializzata. Un processo di "realign-and-elongation" rinnova i termini 3' delle molecole di v- e cRNA da template interni durante ogni round di replicazione e può avvenire solo se i termini sono completi, fornendo una fase meccanicistica esplicita che funge da checkpoint di controllo qualità per l'integrità del genoma[26]. Questo processo fornisce un controllo qualità integrato che sopprime la replicazione delle molecole di RNA con delezioni terminali, collegando la logica di riparazione delle estremità alla selezione contro gli intermedi di replicazione difettosi[26]. In parallelo, le analisi dei termini genomici durante l'infezione persistente a lungo termine hanno riportato un grado più elevato di eterogeneità terminale negli RNA provenienti da cellule persistentemente infette rispetto ai punti temporali acuti, indicando che la persistenza è accompagnata da spostamenti nella distribuzione delle varianti delle estremità del genoma[11].
La persistenza è anche associata a un contesto nucleare stabile per le RNP. I bornavirus sono stati descritti come unici tra i virus NNS RNA animali noti che replicano e trascrivono nel nucleo, il che fornisce l'ambiente compartimentale cellulare per la sintesi di RNA non citolitica a lungo termine e il processamento nucleare delle estremità del genoma[2]. Inoltre, BoDV-1 costruisce le sue vRNP utilizzando la cromatina dell'ospite come impalcatura, una proprietà che può supportare meccanicamente la persistenza nel nucleo stabilizzando il posizionamento delle vRNP rispetto alla cromatina[27].
La modulazione della risposta dell'ospite è stata anche collegata sperimentalmente agli stati di infezione. Le cellule infettate da BDV hanno secreto meno SEAP rispetto alle cellule mock dopo l'attivazione con Pam3CSK4, suggerendo che le cellule infettate da BDV sopprimano attivamente la segnalazione di NF-κB, il che fornisce un correlato a livello molecolare per l'alterazione della segnalazione innata durante l'infezione persistente[28].
Open questions
Diverse questioni molecolari rimangono aperte o sono posizionate per una sperimentazione mirata basata sui risultati meccanicistici sopra riassunti.
- Quali determinanti di sequenza e strutturali controllano l'efficienza di terminazione di BDV e l'elevata frequenza di trascritti di readthrough, in particolare in T3 dove il readthrough è essenziale per l'espressione della polimerasi[5, 9]?
- In che modo gli eventi di splicing alternativo negli RNA da 2.8-kb e 7.1-kb si interfacciano con l'uso dei confini trascrizionali per produrre stoichiometrie corrette di G e dei prodotti correlati alla polimerasi, inclusi i casi in cui l'espressione di L richiede lo splicing e la soppressione della terminazione[6, 10]?
- Qual è la relazione quantitativa tra l'eterogeneità terminale osservata durante la persistenza e l'attività del promotore, dato che la perfetta complementarità terminale non è richiesta per un'elevata attività del promotore e i termini si diversificano durante l'infezione a lungo termine[11]?
- In che modo la fase di controllo qualità "realign-and-elongation" è coordinata con l'organizzazione delle RNP nucleari, dato che il rinnovo dei termini 3' deriva da template interni e sopprime la replicazione degli RNA con delezioni terminali[26]?
- Quali fattori dell'ospite e riferimenti nucleari governano la formazione e il posizionamento dei vSPOTs separati in fase guidati da P che interagiscono con la cromatina e si agganciano alle rotture del DNA neuronale a doppio filamento[3]?
- In che modo l'esportazione di nucleoproteine dipendente da CRM1 e l'esportazione di mRNA dipendente dall'energia si integrano per regolare la compartimentazione degli RNA poly(A)+ rispetto all'RNA genomico poly(A)− attraverso l'involucro nucleare[13, 15, 20]?
- Attraverso quale meccanismo molecolare la proteina X sopprime l'accumulo di RNA del minigenoma, e come questa soppressione si interseca con la regolazione negativa dell'attività del cofattore della polimerasi dipendente dalla fosforilazione di P[15, 23]?
