Abstrakt
Bornaviry (např. virus Bornské choroby, BDV; virus Bornské choroby 1, BoDV-1) jsou nesegmentované, negativní jednovláknové RNA viry, jejichž nejvýraznějším rysem mezi živočišnými nesegmentovanými negativními RNA (NNS-RNA) viry je, že transkripce a replikace genomu probíhají v jádře hostitelské buňky, nikoliv převážně v cytoplazmě[1–3]. Molekulární studie BDV definovaly kompaktní genom o velikosti ~8.9–9 kb s více otevřenými čtecími rámci organizovanými do malého počtu transkripčních jednotek a lemovanými extracistronickými terminálními sekvencemi, které fungují jako promotory a regulační hranice pro syntézu virové RNA[4–8]. Genová exprese je komplexní a zahrnuje produkci mono- i polycistronických poly(A)+ RNA, častý readthrough na terminačních místech a využití splicingu pro expresi klíčových produktů, včetně polymerázy (L) v některých kontextech transkriptů[4–6, 9, 10]. Systémy funkční rekonstituce a minigenomů zmapovaly požadavky na cis-působící promotory na 3′ konci genomu a ukázaly, že N a P enkapsidují templáty rozpoznávané polymerázovým komplexem L/P za účelem generování replikačních i transkripčních produktů[11, 12]. Nukleární organizace a transport dále formují replikační program, přičemž virové „skvrny transkriptů“ (vSPOTs) a export nukleoproteinu závislý na CRM1 přispívají k dynamice RNP a kompartmentalizaci poly(A)+ oproti poly(A)− virovým RNA[3, 13–15].
Klíčová slova
- Bornavirus[1]
- Borna disease virus[4]
- nesegmentovaný negativní RNA virus[4]
- nukleární replikace[2]
- transkripční readthrough[5]
- vSPOTs[3]
- minigenom[11]
- export CRM1[15]
- fosfoprotein P[15]
- RNA-dependentní RNA polymeráza L[16]
Úvod
Bornaviry jsou NNS-RNA viry, jejichž promotory a konsenzuální sekvence začátku genů odpovídají vzorcům pozorovaným napříč čeleděmi řádu Mononegavirales, což naznačuje sdílenou logiku transkripce negativního vlákna na úrovni cis-působících iniciačních prvků[4, 17]. Hlavním mechanistickým rozdílem je, že zatímco většina mononegavirů se replikuje hlavně v cytoplazmě, bornaviry se replikují v jádře, kde vytvářejí specializovaná nukleární místa pro syntézu virové RNA[1, 3]. Experimentální důkazy specificky potvrzují, že replikace a transkripce BDV probíhají v jádrech infikovaných buněk a jsou spojeny s infekčními ribonukleoproteinovými komplexy (BDV-RNP), což zdůrazňuje, že syntéza bornavirální RNA je prováděna v kontextu nukleárních RNP[4, 13]. Nukleární lokalizace je dále podpořena buněčnou frakcionací, která ukazuje, že většina nově syntetizované BDV RNA s genomovou polaritou je poly(A)− a nachází se převážně v nukleární frakci, což je v souladu s nukleární replikací genomové RNA[13].
Organizace genomu
Sekvenování a mapování genomu BDV identifikovalo lineární genom o velikosti ~8.9 kb s hlavními otevřenými čtecími rámci předpovězenými napříč genomem a lemovanými nekódujícími sekvencemi na obou koncích[4, 5]. V jedné zprávě bylo v sekvenci genomu BDV o délce 8,903-nt predikováno pět hlavních ORF (I–V), zatímco jiný popis genomu BDV (8,910 nt) podobně zaznamenal antisense informaci pro pět hlavních ORF lemovaných 53 nt nekódující sekvence na 3′ konci a 91 nt na 5′ konci[4, 5]. Kromě rámování pěti ORF popsalo mapování na úrovni antigenomu tři transkripční jednotky a šest ORF, a přehledové souhrny rovněž popisují BDV jako kódující šest ORF ve třech transkripčních jednotkách rámovaných komplementárními konci připomínajícími ostatní NNS RNA viry[6, 7].
Největší kódující oblast (ORF V) kóduje predikovaný protein o velikosti ~170 kDa se silnou homologií k rodině L-proteinů polymeráz NNS-RNA virů, což řadí virovou RNA-dependentní RNA polymerázu na 5′-proximální konec sady genů v kanonickém uspořádání negativního vlákna[4]. Analýza konzervovaných sekvencí identifikovala nejvyšší homologii v domnělé katalytické doméně s invariantními a konzervativně udržovanými rezidui seskupenými do čtyř vysoce konzervovaných motivů (A–D), což je v souladu s konzervovanými enzymatickými omezeními funkce polymerázy u NNS-RNA virů[18]. Infekční BDV-RNP obsahují podle zpráv pouze jeden druh BDV RNA, a to poly(A)− RNA s negativní polaritou o délce 9-kb, což potvrzuje, že poly(A)− RNA o délce genomu je enkapsidovaným templátovým druhem v infekčních RNP[13].
Genomy bornavirů nesou také regulační hraniční oblasti typické pro NNS-RNA viry, přičemž ORF jsou lemovány netranslatovanými hraničními sekvencemi, které zahrnují signály pro zahájení a ukončení transkripce[8]. Terminální sekvence se mohou párovat a vytvářet strukturu podobnou panhandle (rukojeti pánve) a u BDV zarovnání genomových konců umožnilo vytvoření terminálního panhandle s prvními 3 nukleotidy nepárovanými, což propojuje terminální komplementaritu s architekturou promotoru bez nutnosti dokonalého duplexu[5]. Důležité je, že analýzy genomových konců BDV uváděly jak nedostatek dokonalé terminální komplementarity, tak zvýšenou heterogenitu terminálních sekvencí během dlouhodobé persistence, což naznačuje, že cis-působící terminální oblasti jsou variabilní, avšak funkčně tolerované napříč stavy infekce[11].
Pro stručné shrnutí architektury genomu a genové exprese popsané v těchto zdrojích uvádí tabulka níže srovnání několika často citovaných organizačních prvků.
Transkripce a genová exprese
Genová exprese bornavirů u BDV zahrnuje více polyadenylovaných subgenomických RNA komplementárních k negativnímu genomu, přičemž jedna studie identifikovala devět druhů polyadenylovaných subgenomických RNA, včetně šesti polycistronických poly(A)+ RNA a monocistronických mRNA odpovídajících ORF I, II a IV[4]. Ve stejné analýze nebyly detekovány monocistronické poly(A)+ RNA pro ORF III a V, což naznačuje, že expresi některých kódujících oblastí u BDV nedominuje jednoduchá monocistronická zpráva[4]. Analýzy typu Northern blot také ukázaly, že BDV transkribuje mono- i polycistronické RNA a využívá terminační/polyadenylační signály připomínající ostatní negativní RNA viry, což je v souladu s transkripčním programem typu stop–start, který přesto poskytuje častou kontinuitu transkriptu i za terminačními místy[5].
Terminace a polyadenylace zahrnují diskrétní místa a rozpoznatelný signál. Experimenty s Northern hybridizací podpořily využití specifických terminačních míst (T2, T3, T5 a T7) a identifikovaly konsenzuální sekvenci terminačního/polyadenylačního signálu, což poskytuje molekulární orientační body pro hranice transkriptů a sklon k readthrough[5]. BDV je také pozoruhodný vysokou frekvencí readthrough transkriptů ve srovnání s jinými negativními RNA viry, což naznačuje, že účinnost terminace je systematicky laděna a může být mechanisticky zásadní[5]. Readthrough T3 je skutečně nezbytný pro expresi p190 (polymerázový protein), což přímo spojuje supresi terminace s dostupností polymerázy a tím i s kapacitou pro replikaci a transkripci[9].
mRNA BDV jsou opatřeny čepičkou a polyadenylovány, což prokazuje, že maturace mRNA je v souladu s produkcí RNA schopných translace i přes niku nukleární replikace[19]. Další diverzita kódujících sekvencí je generována splicingem, protože 2.8-kb a 7.1-kb RNA obsahují dva introny, které jsou diferencovaně sestřihovány za vzniku RNA kódujících více produktů včetně G a proteinů souvisejících s polymerázou; samostatná vyjádření uvádějí, že exprese L vyžaduje splicing a supresi terminace[6, 10]. Na úrovni iniciace a struktury promotoru se nezdá, že by pro vysokou aktivitu promotoru byla vyžadována dokonalá terminální komplementarita, a zvýšená terminální komplementarita nepodporovala replikaci oproti transkripci polymerázou BDV, což naznačuje, že rovnováha mezi replikací a transkripcí není pouhou funkcí síly terminálního párování bází[11].
Přehled replikačního cyklu
Replikace bornavirů je definována nukleární syntézou RNA a nukleární organizací virových RNP. Více zdrojů poskytuje důkazy, že replikace a transkripce BDV probíhají v jádře ve spojení s infekčními BDV-RNP, čímž se potvrzuje, že funkčním templátem pro syntézu RNA je RNP komplex působící v nukleárním prostředí[4, 13]. Kvantitativní frakcionace a experimenty se značením dále ukázaly, že většina nově syntetizované RNA s genomovou polaritou BDV je poly(A)− a nukleární, což podporuje závěr, že replikace genomu probíhá v jádře infikovaných buněk[13].
Pro různé třídy virových RNA se objevuje konzistentní vzorec kompartmentalizace. BDV 9-kb poly(A)− RNA je převážně nukleární, zatímco nově syntetizované poly(A)+ RNA jsou transportovány do cytoplazmatického kompartmentu, což naznačuje, že export mRNA a retence genomu jsou odděleny přes jaderný obal[13, 14]. Ukázalo se, že transport mRNA BDV je závislý na energii, což implikuje aktivní export spíše než pasivní difuzi jako klíčový kontrolní bod pro genovou expresi při infekci nukleárními bornaviry[20].
Bornaviry také sestavují nukleární virové továrny popsané jako „virové skvrny transkriptů“ (vSPOTs), které poskytují strukturální kontext pro koncentrovanou transkripci/replikaci a potenciálně koordinované zpracování RNA v jádře[1]. U BoDV-1 jsou vSPOTs tvořené separací fází kapalina-kapalina řízenou proteinem P přítomny v jádře a úzce interagují s chromatinem, včetně dokování na dvouřetězcových zlomech neuronální DNA, čímž propojují replikační místa se specifickými nukleárními substrukturami[3]. V souladu s ústřední rolí RNP bylo uváděno, že komplexy BDV-RNP obsahující pouze druh 9-kb RNA vykazují polymerázovou aktivitu vyžadovanou pro transkripci a nesou genetickou informaci potřebnou k řízení syntézy makromolekul BDV a produkci infekčních částic BDV, čímž propojují RNP o délce genomu s následnými kroky v životním cyklu viru[21].
Aparát RNP a polymerázy
Genomová RNA BDV je zabalena do RNP komplexů, které obsahují N a virový komplex RNA-dependentní RNA polymerázy, což definuje jádro aparátu jako nukleokapsidový templát vázaný polymerázovým komplexem[15]. RdRp komplex se skládá z P a L a je zodpovědný za replikaci a transkripci virového genomu, což určuje L jako katalytickou podjednotku a P jako nezbytný polymerázový kofaktor u BDV[15]. Strukturní a funkční popisy dále definují L jako RdRp o velikosti ~192 kDa tvořící jádro replikačního komplexu, provádějící transkripci a replikaci za účelem produkce virové mRNA a nových kopií genomu, a asociující s P pro efektivní syntézu RNA[16].
Interakční vlastnosti proteinu P poskytují mechanistický vhled do funkce polymerázy. P se autoneasociuje do oligomerů prostřednictvím centrální oligomerizační domény a přemosťuje RdRp a nukleokapsid; rovněž funguje jako chaperon pro N, aby jej udržel ve formě bez RNA potřebné pro replikaci, což podporuje model, v němž P koordinuje jak nábor enzymů, tak připravenost templátu[3]. Experimentální narušení oligomerizace P v testu s minireplikony konzistentně řešilo, zda mutanty P s defektní oligomerizací mohou rekonstituovat funkční polymerázové komplexy, přičemž žádný z mutantů P nepodporoval expresi reportéru, což naznačuje, že oligomerizace P je za těchto podmínek vyžadována pro aktivitu polymerázy[22]. Kofaktorová aktivita P pro BDV RdRp je navíc negativně regulována fosforylací, což poskytuje explicitní posttranslační regulační páku pro funkci polymerázy[15].
Izoformy nukleoproteinu bornavirů také propojují funkci proteinů s intracelulární lokalizací. Experimenty s expresí p40 a p38 ukázaly, že p40 je primárně nukleární, zatímco p38 je primárně cytoplazmatický, avšak oba vážou BDV fosfoprotein P, což naznačuje, že lokalizace závislá na izoformě spojená s vazbou na P může modulovat místo, kde dochází k sestavení a/nebo funkci RNP[9]. V souladu s úlohou P v nukleárním cílení obsahuje P na svém amino-konci silný bipartitní nukleární lokalizační signál (NLS) a další slabší motivy NLS, což podporuje nukleární import komplexů obsahujících polymerázu jako mechanistický předpoklad pro nukleární syntézu RNA[9].
A konečně, akcesorní protein X může přímo tlumit syntézu RNA v rekonstituovaných systémech. Když byly polymerázové komplexy BDV rekonstituovány v buňkách exprimujících protein X, nebyla detekována žádná plus-vláknová minigenomová RNA, což naznačuje, že X v tomto kontextu testu inhibuje jak virovou transkripci, tak replikaci[23]. Tato pozorování společně podporují model aparátu, ve kterém L a P tvoří katalytické jádro, oligomerizace a fosforylace P regulují kompetenci polymerázy a akcesorní faktory, jako je X, mohou potlačit výkon polymerázy za definovaných podmínek[15, 23].
Nukleární transport
Bornaviry spojují nukleární replikaci s regulovaným nukleocytoplazmatickým transportem komponent RNP a druhů RNA. Přímé důkazy naznačují, že replikace a transkripce BDV probíhají v jádrech, kde jsou přítomny infekční BDV RNP, a frakcionace ukazuje, že nově syntetizovaná RNA s genomovou polaritou je silně obohacena v nukleární frakci, což poskytuje funkční impuls pro koordinaci životního cyklu prostřednictvím drah nukleárního importu a exportu[13, 21]. Testy transportu RNA naznačují, že nově syntetizované poly(A)+ RNA BDV jsou efektivně transportovány do cytoplazmatického kompartmentu, zatímco 9-kb genomová RNA zůstává většinou v jádře, což prokazuje exportní chování specifické pro třídu RNA[14]. Transport mRNA je navíc závislý na energii, s minimálním exportem v nepřítomnosti ATP, což podporuje aktivní mechanismy exportu virových mRNA závislé na hostitelských faktorech[20].
U transportu proteinů se u nukleoproteinu předpokládá export závislý na CRM1. Nukleární export N probíhá cestou závislou na CRM1 v souladu s NES a samostatné prohlášení podobně uvádí, že nukleární export BoDV-N probíhá cestou závislou na CRM1, což naznačuje konzervaci této exportní cesty u bornavirů[15, 24]. Širší přehledy dále uvádějí, že k nukleocytoplazmatickému transportu BDV RNP přispívá několik proteinů BDV (včetně nukleoproteinu, fosfoproteinu, X a L) a že směrová kontrola je pravděpodobně určena poměry a interakcemi mezi prvky NLS a NES v RNP, což transport rámuje jako výslednou vlastnost soupeřících lokalizačních signálů spíše než jako jediný determinant[25].
Tvorba nukleární virové továrny poskytuje další organizační úroveň relevantní pro transport. Bornaviry sestavují v jádře vSPOTs a vSPOTs BoDV-1 jsou tvořeny separací fází kapalina-kapalina řízenou proteinem P a úzce interagují s chromatinem, což může omezovat difuzi a potenciálně řídit umístění míst transkripce/replikace vzhledem k jaderným orientačním bodům hostitele[1, 3].
Reverzní genetika a promotorové prvky
Cis-působící regulační signály bornavirů jsou koncentrovány v netranslatovaných hraničních a terminálních oblastech. U BDV jsou ORF lemovány netranslatovanými hraničními sekvencemi obsahujícími regulační signály pro zahájení a ukončení transkripce, což je v souladu s architekturou typu Mononegavirales, kde signály začátku a konce genů vedou chování polymerázy podél genomu[8]. Odvozená konsenzuální sekvence začátku BDV (UNCNNNUUNN) je identická se sekvencí vyvozenou porovnáním NNS-RNA virů napříč více čeleděmi řádu Mononegavirales, což podporuje konzervaci iniciačního motivu používaného polymerázovým aparátem[4, 17]. Terminační/polyadenylační signály zahrnují konzervovaný hexamer AUUUUU na 5′ konci každého terminačního/polyadenylačního signálu následovaný GG (nebo CG v ORF II), zatímco u ORF III se v jedné analýze nepodařilo identifikovat domnělé signály, což naznačuje jak konzervaci, tak mezery v detekovatelnosti motivů napříč hranicemi genů[4].
Přístupy reverzní genetiky a minigenomů tyto regulační prvky přímo testovaly. Pro intracelulární rekonstituci replikace a transkripce BDV RNA byl vytvořen systém RNA polymerázy I/polymerázy II, který umožňuje kontrolovanou analýzu cis- a trans-působících požadavků[11]. V tomto systému je analog BDV RNA (minigenom) syntetizován buněčnou RNA polymerázou I a obsahuje 5′ a 3′ netranslatované cis-působící sekvence BDV vyžadované pro syntézu RNA zprostředkovanou BDV polymerázou, čímž propojuje terminální oblasti s funkcí promotoru v buňkách[11]. Enkapsidace minigenomové RNA odvozené od polymerázy I pomocí plazmidem dodaných BDV N a P generuje templát rozpoznávaný rekonstituovanou BDV polymerázou k řízení syntézy antiminigenomové RNA v plné délce (replikace) a subgenomické mRNA kódující reportérový gen, což experimentálně dokazuje, že enkapsidace N a P je dostatečná k tomu, aby byla RNA schopna rozpoznání polymerázou a syntézy RNA s duálním výstupem[11].
Mapování promotorů dále zpřesňuje cis-působící model. Pro optimální aktivitu promotoru byly vyžadovány následné sekvence (nukleotidy 25 až 33) a delece nukleotidů 34 až 35 v tomto kontextu zrušila aktivitu reportéru, čímž byly identifikovány krátké, pozičně specifické požadavky v blízkosti promotoru v oblasti 3′ genomového promotoru[12]. Tyto údaje společně podporují architekturu promotoru, v níž kompaktní terminální sekvence a blízké následné prvky řídí iniciaci a produktivní replikaci/transkripci v rekonstituovaném polymerázovém systému[11, 12].
Mechanismy persistence
Molekulární persistence bornavirů je spojena s dynamikou konců genomu, nukleární replikací a specializovanou nukleární organizací. Proces „realign-and-elongation“ obnovuje 3′ konce molekul v- a cRNA z interních templátů během každého kola replikace a může nastat pouze tehdy, jsou-li konce kompletní, což poskytuje explicitní mechanistický krok, který funguje jako kontrolní bod kvality pro integritu genomu[26]. Tento proces poskytuje integrovanou kontrolu kvality, která potlačuje replikaci molekul RNA s terminálními delecemi, čímž propojuje logiku opravy konců se selekcí proti defektním replikačním intermediátům[26]. Analýzy genomových konců během dlouhodobé perzistentní infekce paralelně uváděly vyšší stupeň terminální heterogenity u RNA z perzistentně infikovaných buněk ve srovnání s akutními časovými body, což naznačuje, že persistenci doprovázejí posuny v distribuci variant konců genomu[11].
Persistence je také spojena se stabilním nukleárním kontextem pro RNP. Bornaviry byly popsány jako jedinečné mezi známými živočišnými NNS RNA viry tím, že se replikují a transkribují v jádře, což poskytuje prostředí buněčného kompartmentu pro dlouhodobou necytolytickou syntézu RNA a nukleární zpracování konců genomu[2]. BoDV-1 navíc konstruuje své vRNP s využitím hostitelského chromatinu jako lešení, což je vlastnost, která může mechanisticky podporovat persistenci v jádře stabilizací polohy vRNP vzhledem k chromatinu[27].
Modulace hostitelské odpovědi byla také experimentálně spojena se stavy infekce. Buňky infikované BDV vylučovaly po aktivaci Pam3CSK4 méně SEAP než falešně infikované (mock) buňky, což naznačuje, že buňky infikované BDV aktivně potlačují signalizaci NF-κB, což poskytuje korelát na molekulární úrovni pro změněnou vrozenou signalizaci během perzistentní infekce[28].
Otevřené otázky
Několik molekulárních otázek zůstává otevřených nebo je připraveno pro cílené experimentování na základě mechanistických zjištění shrnutých výše.
- Které sekvenční a strukturní determinanty řídí účinnost terminace BDV a vysokou frekvenci readthrough transkriptů, zejména u T3, kde je readthrough nezbytný pro expresi polymerázy[5, 9]?
- Jak události alternativního splicingu u 2.8-kb a 7.1-kb RNA spolupracují s využitím transkripčních hranic za účelem dosažení správné stechiometrie G a produktů souvisejících s polymerázou, včetně případů, kdy exprese L vyžaduje splicing a supresi terminace[6, 10]?
- Jaký je kvantitativní vztah mezi terminální heterogenitou pozorovanou během persistence a aktivitou promotoru, vzhledem k tomu, že pro vysokou aktivitu promotoru není vyžadována dokonalá terminální komplementarita a konce se během dlouhodobé infekce diverzifikují[11]?
- Jak je krok kontroly kvality „realign-and-elongation“ koordinován s nukleární organizací RNP, vzhledem k tomu, že obnova 3′ konců pochází z interních templátů a potlačuje replikaci RNA s terminálními delecemi[26]?
- Které hostitelské faktory a nukleární orientační body řídí tvorbu a umístění fázově separovaných vSPOTs řízených proteinem P, které interagují s chromatinem a dokují na dvouřetězcových zlomech neuronální DNA[3]?
- Jak se export nukleoproteinu závislý na CRM1 a energeticky závislý export mRNA integrují do regulace kompartmentalizace poly(A)+ RNA oproti poly(A)− genomové RNA přes jaderný obal[13, 15, 20]?
- Jakým molekulárním mechanismem protein X potlačuje akumulaci minigenomové RNA a jak se toto potlačení protíná s negativní regulací aktivity polymerázového kofaktoru závislou na fosforylaci P[15, 23]?
