Resumen
Los Bornavirus (p. ej., Borna disease virus, BDV; Borna disease virus 1, BoDV-1) son virus de RNA monocatenario de sentido negativo no segmentados, cuya característica más distintiva entre los virus de RNA de cadena negativa no segmentados (NNS-RNA) animales es que la transcripción y replicación del genoma ocurren en el núcleo de la célula huésped en lugar de hacerlo predominantemente en el citoplasma[1–3]. Los estudios moleculares del BDV han definido un genoma compacto de ~8.9–9 kb con múltiples marcos de lectura abiertos organizados en un número pequeño de unidades de transcripción y flanqueados por secuencias terminales extracistrónicas que funcionan como promotores y límites regulatorios para la síntesis de RNA viral[4–8]. La expresión génica es compleja e incluye la producción de RNA poly(A)+ tanto monocistrónicos como policistrónicos, un readthrough frecuente en los sitios de terminación y el uso de splicing para la expresión de productos clave, incluida la polimerasa (L), en algunos contextos de transcripción[4–6, 9, 10]. La reconstitución funcional y los sistemas de minigenoma han mapeado los requerimientos del promotor que actúa en cis en el extremo genómico 3′ y han demostrado que N y P encapsidan moldes reconocidos por el complejo de polimerasa L/P para generar productos tanto replicativos como transcripcionales[11, 12]. La organización y el tráfico nuclear moldean aún más el programa de replicación, con "moteados virales de transcritos" (vSPOTs) y la exportación de nucleoproteína dependiente de CRM1, lo que contribuye a la dinámica de RNP y a la compartimentación de los RNA virales poly(A)+ frente a los poly(A)−[3, 13–15].
Palabras clave
- Bornavirus[1]
- Borna disease virus[4]
- virus de RNA de cadena negativa no segmentado[4]
- replicación nuclear[2]
- readthrough de transcripción[5]
- vSPOTs[3]
- minigenoma[11]
- exportación de CRM1[15]
- fosfoproteína P[15]
- RNA polimerasa dependiente de RNA L[16]
Introducción
Los Bornavirus son virus NNS-RNA cuyas secuencias de consenso de promotor e inicio de gen se alinean con los patrones observados en las familias de Mononegavirales, lo que indica una lógica de transcripción de cadena negativa compartida a nivel de elementos de iniciación que actúan en cis[4, 17]. Una distinción mecánica central es que, mientras que la mayoría de los mononegavirus se replican principalmente en el citoplasma, los bornavirus se replican en el núcleo, donde establecen sitios nucleares especializados para la síntesis de RNA viral[1, 3]. La evidencia experimental respalda específicamente que la replicación y transcripción del BDV ocurren en los núcleos de las células infectadas y están asociadas con complejos de ribonucleoproteína infecciosos (BDV-RNPs), enfatizando que la síntesis de RNA de los bornavirus se ejecuta en el contexto de las RNP nucleares[4, 13]. La localización nuclear se ve respaldada además por el fraccionamiento celular, que muestra que la mayor parte del RNA del BDV de polaridad genómica recién sintetizado es poly(A)− y se encuentra principalmente en la fracción nuclear, lo cual es consistente con la replicación nuclear del RNA genómico[13].
Organización del genoma
La secuenciación y el mapeo del genoma del BDV identificaron un genoma lineal de ~8.9 kb con los marcos de lectura abiertos principales predichos a lo largo del genoma y flanqueados por secuencias no codificantes en ambos extremos[4, 5]. En un informe, se predijeron cinco ORF principales (I–V) en una secuencia genómica de BDV de 8,903-nt, mientras que otra descripción del genoma del BDV (8,910 nt) señaló de manera similar información antisentido para cinco ORF principales flanqueados por 53 nt de secuencia no codificante en el extremo 3′ y 91 nt en el extremo 5′[4, 5]. Además del marco de cinco ORF, el mapeo a nivel de antigenoma ha descrito tres unidades de transcripción y seis ORF, y los resúmenes a nivel de revisión describen igualmente al BDV como un virus que codifica seis ORF en tres unidades de transcripción enmarcadas por extremos complementarios que recuerdan a otros virus NNS RNA[6, 7].
La región codificante más grande (ORF V) codifica una proteína predicha de ~170 kDa con una fuerte homología con la familia de proteínas L de las polimerasas de virus NNS-RNA, lo que sitúa a la RNA polimerasa dependiente de RNA viral en el extremo proximal 5′ del conjunto de genes en el diseño canónico de cadena negativa[4]. El análisis de secuencias conservadas identificó la mayor homología en un dominio catalítico putativo con residuos invariantes y mantenidos de forma conservadora agrupados en cuatro motivos altamente conservados (A–D), consistente con las restricciones enzimáticas conservadas en la función de la polimerasa entre los virus NNS-RNA[18]. Se ha informado que las BDV-RNPs infecciosas contienen solo una especie de RNA de BDV, el RNA de 9-kb de polaridad negativa poly(A)−, lo que respalda que el RNA poly(A)− de longitud genómica es la especie de molde encapsidada en las RNP infecciosas[13].
Los genomas de Bornavirus también portan regiones límite regulatorias típicas de los virus NNS-RNA, con ORF flanqueados por secuencias límite no traducidas que incluyen señales de iniciación y parada de transcripción[8]. Las secuencias terminales pueden emparejarse para formar una estructura similar a un asa de sartén (panhandle), y en el BDV la alineación de los extremos genómicos permitió la formación de un panhandle terminal con los primeros 3 nucleótidos no apareados, vinculando la complementariedad terminal con la arquitectura del promotor sin requerir un dúplex perfecto[5]. Es importante destacar que los análisis de los extremos genómicos del BDV informaron tanto la falta de complementariedad terminal perfecta como un aumento de la heterogeneidad de las secuencias terminales durante la persistencia a largo plazo, lo que indica que las regiones terminales que actúan en cis son variables pero funcionalmente toleradas en los distintos estados de infección[11].
Para resumir de forma concisa la arquitectura del genoma y de la expresión génica según se describe en estas fuentes, la siguiente tabla contrasta varias características organizativas frecuentemente citadas.
Transcripción y expresión génica
La expresión génica de los Bornavirus en el BDV incluye múltiples RNA subgenómicos poliadenilados complementarios al genoma de sentido negativo; un estudio identificó nueve especies de RNA subgenómicos poliadenilados, incluidos seis RNA poly(A)+ policistrónicos y mRNA monocistrónicos correspondientes a los ORF I, II y IV[4]. En el mismo análisis, no se detectaron RNA poly(A)+ monocistrónicos para los ORF III y V, lo que indica que la expresión de algunas regiones codificantes en el BDV no está dominada por mensajes monocistrónicos simples[4]. Los análisis Northern también mostraron que el BDV transcribe tanto RNA monocistrónicos como policistrónicos y utiliza señales de terminación/poliadenilación que recuerdan a otros virus de RNA de cadena negativa, lo cual es consistente con un programa transcripcional de stop-start que, no obstante, produce una frecuencia alta de continuidad de los transcritos más allá de los sitios de terminación[5].
La terminación y la poliadenilación implican sitios discretos y una señal reconocible. Los experimentos de hibridación Northern respaldaron el uso de sitios de terminación específicos (T2, T3, T5 y T7) e identificaron una secuencia de consenso de la señal de terminación/poliadenilación, proporcionando hitos moleculares para los límites del transcrito y la propensión al readthrough[5]. El BDV también destaca por una alta frecuencia de transcritos de readthrough en relación con otros virus de RNA de cadena negativa, lo que implica que la eficiencia de terminación está ajustada sistemáticamente y puede ser esencial desde el punto de vista mecánico[5]. De hecho, el readthrough de T3 es esencial para la expresión de p190 (proteína polimerasa), vinculando directamente la supresión de la terminación con la disponibilidad de la polimerasa y, por tanto, con la capacidad de replicación y transcripción[9].
Los mRNA del BDV están capuchonados (capped) y poliadenilados, lo que demuestra que la maduración del mRNA es consistente con la producción de RNA competentes para la traducción a pesar del nicho de replicación nuclear[19]. Se genera diversidad codificante adicional mediante splicing, ya que los RNA de 2.8-kb y 7.1-kb contienen dos intrones que se procesan mediante splicing diferencial para producir RNA que codifican múltiples productos, incluidas la proteína G y proteínas relacionadas con la polimerasa; declaraciones independientes indican que la expresión de L requiere splicing y supresión de la terminación[6, 10]. A nivel de la iniciación y la estructura del promotor, no parece requerirse una complementariedad terminal perfecta para una alta actividad del promotor, y el aumento de la complementariedad terminal no promovió la replicación frente a la transcripción por parte de la polimerasa del BDV, lo que indica que el equilibrio entre replicación y transcripción no es simplemente una función de la fuerza del emparejamiento de bases terminales[11].
Descripción general del ciclo de replicación
La replicación de los Bornavirus se define por la síntesis de RNA nuclear y la organización nuclear de las RNP virales. Múltiples fuentes proporcionan evidencia de que la replicación y transcripción del BDV ocurren en el núcleo en asociación con BDV-RNPs infecciosas, estableciendo que el molde funcional para la síntesis de RNA es un complejo RNP que opera en el entorno nuclear[4, 13]. Los experimentos cuantitativos de fraccionamiento y marcaje mostraron además que la mayor parte del RNA del BDV de polaridad genómica recién sintetizado es poly(A)− y nuclear, lo que respalda la conclusión de que la replicación del genoma tiene lugar en el núcleo de las células infectadas[13].
Surge un patrón de compartimentación consistente para las diferentes clases de RNA viral. El RNA poly(A)− de 9-kb del BDV es principalmente nuclear, mientras que los RNA poly(A)+ recién sintetizados se transportan al compartimento citoplasmático, lo que indica que la exportación de mRNA y la retención del genoma están separadas a través de la envoltura nuclear[13, 14]. Se ha demostrado que el transporte de los mRNA del BDV depende de energía, lo que implica una exportación activa en lugar de una difusión pasiva como punto de control clave para la expresión génica en la infección por bornavirus nucleares[20].
Los Bornavirus también ensamblan fábricas virales nucleares descritas como "moteados virales de transcritos" (vSPOTs), proporcionando un contexto estructural para la transcripción/replicación concentrada y un procesamiento de RNA potencialmente coordinado en el núcleo[1]. En el BoDV-1, los vSPOTs formados por la separación de fases líquido-líquido impulsada por la proteína P están presentes en el núcleo e interactúan estrechamente con la cromatina, incluyendo el acoplamiento a roturas de doble cadena del DNA neuronal, vinculando los sitios de replicación con subestructuras nucleares específicas[3]. En consonancia con la centralidad de las RNP, se ha informado que los complejos BDV-RNP que contienen solo la especie de RNA de 9-kb poseen la actividad polimerasa requerida para la transcripción y portan la información genética necesaria para dirigir la síntesis de macromoléculas de BDV y la producción de partículas infecciosas de BDV, conectando las RNP de longitud genómica con los pasos posteriores del ciclo de vida viral[21].
Maquinaria de RNP y polimerasa
El RNA de longitud genómica del BDV se empaqueta en complejos RNP que contienen N y el complejo de RNA polimerasa dependiente de RNA viral, definiendo la maquinaria central como un molde de nucleocápside unido por el complejo de la polimerasa[15]. El complejo RdRp consiste en P y L y es responsable de la replicación y transcripción del genoma viral, estableciendo a L como la subunidad catalítica y a P como un cofactor esencial de la polimerasa en el BDV[15]. Las descripciones estructurales y funcionales definen además a L como una RdRp de ~192 kDa que forma el núcleo del complejo de replicación, realizando la transcripción y la replicación para producir mRNA viral y nuevas copias del genoma, y asociándose con P para una síntesis de RNA eficiente[16].
Las propiedades de interacción proteica de P proporcionan una visión mecánica de la función de la polimerasa. P se autoasocia en oligómeros a través de un dominio de oligomerización central y sirve de puente entre la RdRp y la nucleocápside, y también actúa como chaperona de N para mantenerla en una forma libre de RNA necesaria para la replicación, lo que respalda un modelo en el que P coordina tanto el reclutamiento de enzimas como la disponibilidad del molde[3]. De manera consistente, la interrupción experimental de la oligomerización de P en un ensayo de minireplicón abordó si los mutantes de P con defectos en la oligomerización podrían reconstituir complejos de polimerasa funcionales; ninguno de los mutantes de P permitió la expresión del gen reportero, lo que indica que la oligomerización de P es necesaria para la actividad de la polimerasa bajo estas condiciones[22]. Además, la actividad de cofactor de P para la RdRp del BDV está regulada negativamente por fosforilación, proporcionando una palanca regulatoria postraduccional explícita para la función de la polimerasa[15].
Las isoformas de la nucleoproteína de los bornavirus también conectan la función proteica con la localización intracelular. Experimentos que expresaron p40 y p38 mostraron que p40 es principalmente nuclear mientras que p38 es principalmente citoplasmática, aunque ambas se unen a la fosfoproteína P del BDV, lo que sugiere que la localización dependiente de la isoforma junto con la unión a P puede modular dónde ocurre el ensamblaje y/o la función de la RNP[9]. En concordancia con una función de focalización nuclear para P, P contiene una fuerte señal de localización nuclear (NLS) bipartita en su extremo amino-terminal y motivos NLS adicionales más débiles, lo que respalda la importación nuclear de complejos que contienen polimerasa como un prerrequisito mecánico para la síntesis de RNA nuclear[9].
Finalmente, la proteína accesoria X puede modular directamente a la baja la síntesis de RNA en sistemas reconstituidos. Cuando los complejos de polimerasa del BDV se reconstituyeron en células que expresaban la proteína X, no se detectó RNA de minigenoma de cadena positiva, lo que sugiere que X inhibe tanto la transcripción como la replicación viral en ese contexto de ensayo[23]. Estas observaciones juntas respaldan un modelo de maquinaria en el que L y P forman el núcleo catalítico, la oligomerización y fosforilación de P regulan la competencia de la polimerasa, y factores accesorios como X pueden suprimir el rendimiento de la polimerasa bajo condiciones definidas[15, 23].
Tráfico nuclear
Los Bornavirus acoplan la replicación nuclear con un tráfico nucleocitoplasmático regulado de los componentes de la RNP y de las especies de RNA. La evidencia directa indica que la replicación y transcripción del BDV tienen lugar en los núcleos donde las RNPs infecciosas del BDV están presentes, y el fraccionamiento indica que el RNA de polaridad genómica recién sintetizado está fuertemente enriquecido en la fracción nuclear, proporcionando un ímpetu funcional para que las vías de importación y exportación nuclear coordinen el ciclo de vida[13, 21]. Los ensayos de transporte de RNA indican que los RNA poly(A)+ del BDV recién sintetizados se transportan eficientemente al compartimento citoplasmático, mientras que el RNA genómico de 9-kb permanece principalmente nuclear, demostrando un comportamiento de exportación específico de la clase de RNA[14]. Además, el transporte de mRNA depende de energía, con una exportación insignificante en ausencia de ATP, lo que respalda mecanismos de exportación activos y dependientes de factores del huésped para los mRNA virales[20].
Para el tráfico de proteínas, la exportación dependiente de CRM1 está implicada para la nucleoproteína. La exportación nuclear de N se realiza a través de una vía dependiente de CRM1 consistente con una NES, y una declaración independiente informa de manera similar que la exportación nuclear de BoDV-N ocurre a través de una vía dependiente de CRM1, lo que indica la conservación de esta ruta de exportación dentro de los bornavirus[15, 24]. Revisiones más amplias afirman además que varias proteínas del BDV (incluidas la nucleoproteína, la fosfoproteína, X y L) contribuyen al tráfico nucleocitoplasmático de la RNP del BDV, y que el control direccional probablemente está determinado por las proporciones e interacciones entre los elementos NLS y NES en la RNP, enmarcando el tráfico como una propiedad emergente de señales de localización en competencia más que como un único determinante[25].
La formación de fábricas virales nucleares proporciona un nivel organizativo adicional relevante para el tráfico. Los Bornavirus ensamblan vSPOTs en el núcleo, y los vSPOTs de BoDV-1 se forman por la separación de fases líquido-líquido impulsada por la proteína P e interactúan estrechamente con la cromatina, lo que puede restringir la difusión y potencialmente dirigir el posicionamiento de los sitios de transcripción/replicación en relación con los puntos de referencia nucleares del huésped[1, 3].
Genética inversa y elementos del promotor
Las señales regulatorias que actúan en cis de los Bornavirus se concentran en las regiones límite y terminales no traducidas. En el BDV, los ORF están flanqueados por secuencias límite no traducidas que contienen señales regulatorias para la iniciación y parada de la transcripción, consistentes con una arquitectura tipo Mononegavirales de señales de inicio y fin de gen que guían el comportamiento de la polimerasa a lo largo del genoma[8]. Una secuencia de consenso de inicio deducida del BDV (UNCNNNUUNN) es idéntica a la inferida al comparar virus NNS-RNA en múltiples familias de Mononegavirales, lo que respalda la conservación del motivo de iniciación utilizado por la maquinaria de la polimerasa[4, 17]. Las señales de terminación/poliadenilación incluyen un hexámero AUUUUU conservado en el extremo 5′ de cada señal de terminación/poliadenilación seguido de GG (o CG en el ORF II), mientras que no se pudieron identificar señales putativas para el ORF III en un análisis, lo que indica tanto conservación como lagunas en la detectabilidad de los motivos a través de los límites de los genes[4].
Los enfoques de genética inversa y de minigenoma han probado directamente estos elementos regulatorios. Se estableció un sistema de RNA polimerasa I/polimerasa II para la reconstitución intracelular de la replicación y transcripción de RNA del BDV, lo que permitió una disección controlada de los requerimientos que actúan en cis y en trans[11]. En este sistema, un análogo de RNA del BDV (minigenoma) es sintetizado por la RNA polimerasa I celular y contiene secuencias de BDV no traducidas en 5′ y 3′ que actúan en cis, necesarias para la síntesis de RNA mediada por la polimerasa del BDV, vinculando las regiones terminales con la función del promotor en las células[11]. La encapsidación del RNA del minigenoma derivado de la polimerasa I por la N y P del BDV suministradas por plásmidos genera un molde reconocido por la polimerasa del BDV reconstituida para dirigir la síntesis de RNA antiminigenoma de longitud completa (replicación) y de un mRNA subgenómico que codifica un gen reportero, demostrando experimentalmente que la encapsidación de N y P es suficiente para que el RNA sea competente para el reconocimiento por la polimerasa y para la síntesis de RNA de salida dual[11].
El mapeo del promotor refina aún más el modelo de acción en cis. Se requirieron secuencias posteriores (nucleótidos 25 a 33) para una actividad óptima del promotor, y la deleción de los nucleótidos 34 a 35 abrogó la actividad del gen reportero en este contexto, identificando requerimientos cortos y específicos de la posición proximales al promotor en la región del promotor genómico 3′[12]. En conjunto, estos datos respaldan una arquitectura del promotor en la que secuencias terminales compactas y elementos posteriores cercanos gobiernan la iniciación y la replicación/transcripción productiva en el sistema de polimerasa reconstituido[11, 12].
Mecanisimos de persistencia
La persistencia molecular de los Bornavirus está vinculada a la dinámica de los extremos del genoma, a la replicación nuclear y a una organización nuclear especializada. Un proceso de "realineación y elongación" (realign-and-elongation) renueva los extremos 3′ de las moléculas de v- y cRNA a partir de moldes internos durante cada ronda de replicación y solo puede ocurrir si los extremos están completos, proporcionando un paso mecánico explícito que actúa como un punto de control de calidad para la integridad del genoma[26]. Este proceso proporciona un control de calidad integrado que suprime la replicación de moléculas de RNA con deleciones terminales, conectando la lógica de reparación de extremos con la selección contra intermediarios de replicación defectuosos[26]. Paralelamente, los análisis de los extremos genómicos durante la infección persistente a largo plazo informaron de un mayor grado de heterogeneidad terminal en los RNA de células infectadas de forma persistente en comparación con los puntos temporales agudos, lo que indica que la persistencia se acompaña de cambios en la distribución de las variantes de los extremos del genoma[11].
La persistencia también se asocia con un contexto nuclear estable para las RNP. Los Bornavirus se han descrito como únicos entre los virus NNS RNA animales conocidos por replicarse y transcribirse en el núcleo, lo que proporciona el entorno compartimentado celular para la síntesis de RNA no citolítica a largo plazo y el procesamiento nuclear de los extremos del genoma[2]. Además, el BoDV-1 construye sus vRNPs utilizando la cromatina del huésped como andamio (scaffold), una propiedad que puede respaldar mecánicamente la persistencia en el núcleo al estabilizar el posicionamiento de las vRNP en relación con la cromatina[27].
La modulación de la respuesta del huésped también se ha vinculado experimentalmente a los estados de infección. Las células infectadas por BDV secretaron menos SEAP que las células simuladas (mock) tras la activación con Pam3CSK4, lo que sugiere que las células infectadas por BDV suprimen activamente la señalización de NF-κB, lo cual proporciona un correlato a nivel molecular de la señalización innata alterada durante la infección persistente[28].
Preguntas abiertas
Varias preguntas moleculares permanecen abiertas o están posicionadas para una experimentación dirigida basada en los hallazgos mecánicos resumidos anteriormente.
- ¿Qué determinantes secuenciales y estructurales controlan la eficiencia de terminación del BDV y la alta frecuencia de transcritos de readthrough, particularmente en T3 donde el readthrough es esencial para la expresión de la polimerasa[5, 9]?
- ¿Cómo interactúan los eventos de splicing alternativo en los RNA de 2.8-kb y 7.1-kb con el uso de los límites transcripcionales para producir estequiometrías correctas de G y de los productos relacionados con la polimerasa, incluidos los casos en los que la expresión de L requiere splicing y supresión de la terminación[6, 10]?
- ¿Cuál es la relación cuantitativa entre la heterogeneidad terminal observada durante la persistencia y la actividad del promotor, dado que no se requiere una complementariedad terminal perfecta para una alta actividad del promotor y que los extremos se diversifican durante la infección a largo plazo[11]?
- ¿Cómo se coordina el paso de control de calidad de realineación y elongación (realign-and-elongation) con la organización de las RNP nucleares, dado que la renovación de los extremos 3′ deriva de moldes internos y suprime la replicación de los RNA con deleciones terminales[26]?
- ¿Qué factores del huésped e hitos nucleares gobiernan la formación y el posicionamiento de los vSPOTs separados por fases impulsados por P que interactúan con la cromatina y se acoplan a las roturas de doble cadena del DNA neuronal[3]?
- ¿Cómo se integran la exportación de nucleoproteína dependiente de CRM1 y la exportación de mRNA dependiente de energía para regular la compartimentación de los RNA poly(A)+ frente al RNA genómico poly(A)− a través de la envoltura nuclear[13, 15, 20]?
- ¿Mediante qué mecanismo molecular suprime la proteína X la acumulación de RNA de minigenoma, y cómo se cruza esta supresión con la regulación negativa dependiente de la fosforilación de P de la actividad de cofactor de la polimerasa[15, 23]?
